本研究由Yukinori Kazeto（日本水产研究与教育机构Kamiura站）、Toshiomi Tanaka（静冈县水产研究所Hamanako分所）、Hiroshi Suzuki、Yuichi Ozaki（日本水产研究与教育机构Tamaki站）、Haruhisa Fukada（高知大学农学部）和Koichiro Gen（日本水产研究与教育机构西海国立水产研究所）合作完成，成果发表于2019年7月的《Fisheries Science》期刊（Volume 85, Issue 4, pp. 829–837），标题为《Development and validation of enzyme-linked immunosorbent assays specific for follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in Japanese eel》。
学术背景
日本鳗鲡（Anguilla japonica）是日本水产养殖业的重要经济物种，但其完全依赖野生玻璃鳗苗的捕捞，近年来资源量锐减。人工诱导成熟是解决这一问题的关键，但野生和养殖的成年鳗鲡在圈养条件下无法自然性成熟。研究表明，脊椎动物中两种促性腺激素（Gonadotropins, GTHs）——卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone, FSH）和黄体生成素（Luteinizing Hormone, LH）是调控繁殖的核心因子。然而，除鲑科鱼类外，其他硬骨鱼中这两种激素的分化功能尚不明确，主要原因在于缺乏足量的FSH蛋白及可靠的检测方法。因此，本研究旨在开发日本鳗鲡特异的重组GTHs（r-eGTHs）及其酶联免疫吸附测定法（ELISA），以解析其在生殖调控中的作用。
研究流程
重组GTHs的构建与表达
- 载体设计：通过PCR扩增日本鳗鲡FSHβ、LHβ亚基及共同糖蛋白α亚基（eCGA）的cDNA，并设计单链融合蛋白（含GS linker连接β与α亚基）。同时构建嵌合GTHs（rcGTHs），即鳗鲡β亚基与兔CGA（rCGA）的融合蛋白。
- 表达与纯化：利用哺乳动物FreeStyle 293-F细胞表达系统生产重组蛋白（r-eFSH、r-eLH、rcFSH、rcLH），通过镍柱亲和层析（IMAC）纯化，产量为2–5 mg/L培养基。SDS-PAGE显示蛋白分子量约为31–33 kDa，Western blot验证其特异性。
抗体制备与ELISA开发
- 免疫与纯化：用rcGTHs免疫家兔获得多克隆抗体（a-rcFSH、a-rcLH），进一步通过亲和层析纯化出特异性抗体（a-peFSH IgG、a-peLH IgG），并制备生物素标记的F(ab’)₂片段。
- ELISA建立：采用夹心法，包被抗体为a-peGTH IgG，检测抗体为生物素化F(ab’)₂，链霉亲和素-HRP显色。标准曲线显示FSH和LH的检测范围为15–50,000 pg/mL，批内与批间变异系数分别低于7.7%和5.7%。交叉反应性分析表明，LH ELISA对FSH的交叉反应%，而FSH ELISA对LH的交叉反应为8.2%。
垂体与血清样本分析
- 样本来源：18尾雌性日本鳗鲡（人工诱导未成熟个体），分为卵黄发生前期（PV阶段，n=5）和迁移核期（MN阶段，n=13）。MN阶段个体通过每周注射鲑鱼垂体提取物（SPE）诱导成熟。
- 激素含量测定：PV阶段垂体FSH和LH含量分别为60.3±12.5 ng/垂体和161.7±103.0 ng/垂体；MN阶段LH含量显著升高至281±92.4 μg/垂体（较PV阶段增加1700倍）。
LH释放诱导实验
- 处理方案：MN阶段鳗鲡分为对照组（n=4）和LHRHa（促黄体激素释放激素类似物）+匹莫齐特（多巴胺拮抗剂）处理组（n=4）。
- 结果：处理组血清LH水平在48小时内持续上升至>300 ng/mL（对照组无显著变化），1尾个体成功排卵，性腺指数（GSI）显著升高。
主要结果
- 重组蛋白与抗体特性：r-eGTHs和rcGTHs均成功表达，Western blot证实抗体特异性。
- ELISA性能：方法灵敏度高（最低检测限15 pg/mL），且与血清和垂体提取物的稀释曲线平行。
- 激素动态：MN阶段垂体LH大量积累，LHRHa+匹莫齐特可有效诱导其释放，提示多巴胺能抑制鳗鲡LH分泌。
结论与价值
本研究首次建立了日本鳗鲡FSH和LH的特异性ELISA，证实人工诱导成熟过程中LH的积累与释放规律。科学价值在于为硬骨鱼GTHs功能分化研究提供了可靠工具；应用价值体现在优化鳗鲡人工繁殖方案（如精准调控LH释放时间），有望提高卵子质量。
研究亮点
- 技术创新：开发单链重组GTHs及高特异性ELISA，解决非鲑科鱼类GTH检测难题。
- 机制发现：揭示LH在鳗鲡性成熟末期的关键作用及多巴胺对其分泌的抑制效应。
- 应用潜力：为人工繁殖中激素干预策略（如LHRHa+匹莫齐特联用）提供理论依据。
其他价值
嵌合GTHs（鳗鲡β亚基+兔α亚基）的抗体开发策略可推广至其他鱼类，为缺乏纯化天然激素的物种提供研究模板。