本文为类型a，是一篇原创性研究论文的学术报告。
一、研究作者、机构与发表信息
本文的主要作者为Megan G. Behringer和David W. Hall。Megan G. Behringer的第一完成单位（通讯单位）为美国佐治亚大学（University of Georgia）遗传学系，现地址为印第安纳大学（Indiana University）生物学系；David W. Hall同样隶属于佐治亚大学遗传学系。该研究于2015年9月3日投稿，2015年11月6日被接收，2015年11月10日在线发表，并正式刊载于*G3: Genes|Genomes|Genetics*（*G3*）杂志2016年1月第6卷第1期，页码为149–159，DOI为10.1534/g3.115.022129。
二、研究背景与目的
自发突变（spontaneous mutation）是进化的根本动力，也是物种内与物种间遗传差异的最终来源。直接研究自发突变存在两方面的困难：第一，自发突变频率极低，难以获得足够大的样本量；第二，通过自然种群或物种间遗传差异推断突变谱（mutation spectrum）时，自然选择（natural selection）已经对可观测的变异进行了筛选，导致结果存在偏倚。突变累积（mutation accumulation, MA）实验通过在极小的有效种群（effective population size）中长期维持多个初始完全相同的品系，使自然选择对绝大多数新突变基本失效，从而近似随机地累积自发突变，再通过全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）识别这些突变，进而估计突变率（mutation rate）与突变谱。
本文研究的模式生物为粟酒裂殖酵母（*Schizosaccharomyces pombe*），即裂殖酵母（fission yeast）。此前已有研究团队（Farlow等，2015）在本文投稿前一个月发表了规模几乎相同的Sc. pombe MA实验结果。同时，*Sc. pombe*与芽殖酵母（budding yeast）*Saccharomyces cerevisiae*虽然分化时间约在6–12亿年前，但二者生活史相似、培养方式相似、基因组大小与G/C含量接近，因此可用于比较突变参数。作者基于已有报道基因数据和*S. cerevisiae*突变谱，提出了多项先验预测：*Sc. pombe*的单核苷酸突变（single-nucleotide mutation, SNM）率可能更高；SNM偏倚总体应与*S. cerevisiae*相似；小插入/缺失（insertion/deletion, indel）应偏向插入；非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）修复引起的双突变和复杂突变应更多；单倍体*Sc. pombe*中不应出现非整倍体（aneuploidy）。本研究旨在通过大规模MA实验获得*Sc. pombe*的全基因组突变参数估计，检验上述预测，并评估不同实验条件下MA方法的可重复性。
三、研究流程与实验方法
本研究总体流程可分为MA品系构建与传代、DNA测序与突变鉴定、突变验证与错误率估计、相对突变率分析四个主要步骤。
在MA品系构建与传代阶段，作者以*Sc. pombe*单倍体祖先株972 h⁻（ATCC 26189）为起始材料，在YPD固体培养基上30°C培养。从划线分离的祖先菌落中随机选取96个独立菌落建立96个MA品系。每个品系每48小时从平板上随机挑取一个单菌落转移到新平板，实现单细胞瓶颈（bottleneck）。品系共传代100次，历时200天。每10次传代后，每个品系随机挑取一个菌落冷冻保存于-80°C。同时，每10次传代拍摄所有品系的菌落照片，并利用ImageJ软件测量菌落面积。在传代第10次（t10）和第100次（t100）时，通过血球计数板对不同大小菌落进行细胞计数，建立菌落面积与细胞数的标准曲线。利用每10次传代的平均菌落面积估算该时点的平均细胞数，并依据无死亡条件下细胞数等于2^g（g为世代数）的关系估算每次传代的细胞世代数，最终推算整个实验平均经历1952个细胞世代。通过计算各世代细胞数的调和平均数，估计平均有效种群大小约为10.26个细胞。
在DNA测序与突变鉴定阶段，作者从t100冷冻保存的品系中复苏培养，提取基因组DNA，利用Kapa文库制备试剂盒构建全基因组鸟枪法文库，插入片段约300 bp，片段长度100 bp双端测序。96个MA品系和2个祖先样品在同一批次中合并，在Illumina HiSeq 2000上测序。原始数据已提交至NCBI BioProject SRP065886。原始读数首先用ea-utils和FASTX toolkit进行质量控制（quality control, QC），然后用BWA v1.1.2比对到*Sc. pombe*参考基因组ASM294v2.24，用SAMtools v1.0排序和索引，用Picard tools v1.87标记重复序列并去除，再用GATK v3.2.2进行局部重比对。随后使用GATK UnifiedGenotyper以单倍体参数设置同时识别各品系和祖先样品中的SNM和indel。变异检测要求最少4条读数支持且至少75%的读数支持变异等位基因。着丝粒、端粒和交配型位点等约472 kbp区域被排除，以避免错误比对。鉴定出的SNM和小indel使用Ensembl Variant Effect Predictor（VEP）进行注释。中等和大型结构变异使用Delly软件包检测，疑似变异进一步在Integrative Genomics Viewer（IGV）中人工核查，并对通过核查的变异进行PCR验证。为估算基因表达水平，作者还对祖先株的10个生物学重复进行了mRNA测序，使用TopHat v2.0.13和Cufflinks进行比对和组装，以log-median FPKM作为表达水平的替代指标。
在突变验证与错误率估计阶段，作者随机选择5个MA品系，对其所有预测突变进行Sanger测序验证。共检测15个SNM、20个小插入、3个小删除、1个双SNM和1个复杂突变，Sanger测序全部证实，表明假阳性率（false positive rate）可能不超过0.025并且非常接近于零。为估计假阴性率（false negative rate），作者利用祖先株相对于参考基因组的272个已知差异位点，检查这些位点是否在每个MA品系中被检出。结果表明，SNM的假阴性率为0.0001，小插入和小删除的假阴性率分别为0.011和0.017。
在相对突变率分析阶段，作者将基因组划分为10 kb非重叠窗口，按G/C含量分组，计算各组相对突变率。复制时间（replication time）根据每个SNM最接近的复制起点（origin of replication, ori）的已知起始时间进行分配。转录丰度（transcript abundance）按log10 FPKM值分为15个区间进行分析。此外，还分析了三核苷酸上下文（trinucleotide context）对突变率的影响，将64种三核苷酸按互补配对合并为32组，比较中心位点的相对突变率。
四、主要研究结果
通过测序和质量控制，作者最终保留了79个MA品系，共鉴定出696个自发突变。其中，326个为独立SNM，288个为小插入（<50 bp），47个为小删除（<50 bp），另有123个SNM存在于双SNM（double SNM）或复杂突变（complex mutation）中。SNM率为每碱基每代1.70 ± 0.13 × 10⁻¹⁰；若包括双SNM和复杂突变中的SNM，则全基因组突变率上升至2.34 ± 0.23 × 10⁻¹⁰。
在SNM偏倚方面，转换/颠换比（transition/transversion, Ts/Tv）为0.72。在转换中，G:C→A:T突变是A:T→G:C的2.02倍；在颠换中，G:C→T:A突变是A:T→C:G的4.55倍。总体上，G/C→A/T突变是A/T→G/C的2.97倍。若仅由突变偏倚决定，预测的基因组平衡G/C含量为25.14%，远低于实际观测到的36.06%。三核苷酸上下文分析显示，A:T碱基对中心位置的突变率不受上下文影响；而C:G碱基对在CCG（等价于CGG）、GCG（等价于CGC）和GCA（等价于TGC）三核苷酸组中突变率显著升高（Bonferroni校正后P值分别为0.0003、0.0001和0.0009）。其中CCG和GCG均含CpG二核苷酸。值得注意的是，在CpG位点发生的44个突变中，23个为C→A（52.3%），18个为C→T（40.1%），3个为C→G（6.6%），与全基因组突变谱无显著差异（χ²=1.76，P=0.41）。这表明CpG位点的高突变率并非由甲基化胞嘧啶脱氨基导致，因为脱氨基应主要产生C→T转换而非C→A颠换。
小indel方面，插入数是删除数的6.13倍，插入平均长度为1.6 bp，删除平均长度为3.1 bp，所有品系基因组净增加340 bp。小indel率约为每碱基每代0.174 × 10⁻⁹，与SNM率几乎相同。indel在编码区显著偏低（观测33个，期望191个；P<0.001），而在非编码区显著偏高。双SNM率为8.84 × 10⁻¹²，复杂突变率为8.32 × 10⁻¹²。未检测到任何非整倍体。18个复杂突变中有6个发生在9个絮凝素基因（flocculin gene）中的3个基因内，且均位于这些基因特有的串联重复序列中，作者认为这可能是由于这些区域易于发生双链断裂并引发易错的NHEJ修复。
在G/C含量、复制时间和转录丰度对局部突变率的影响方面，本研究均未发现显著效应。SNM在各品系间的分布不符合泊松分布（Poisson distribution），但符合负二项分布（negative binomial distribution），平均值为4.13，过度离散参数为2.06，提示存在一定的突变率异质性。
五、研究结论与意义
本研究的主要结论包括：第一，*Sc. pombe*的碱基突变率与*S. cerevisiae*几乎相同，结合基因组多态性数据推算的有效种群大小也相近。第二，两种酵母在突变谱和indel率上存在明显差异，*Sc. pombe*表现出强烈的插入偏倚。第三，CpG位点在无DNA甲基化的*Sc. pombe*中仍具有高突变率，且突变谱以C→A为主而非C→T，说明CpG高突变性存在甲基化非依赖机制。第四，Farlow等（2015）研究的SNM率和突变谱与本研究高度一致，尽管菌株、培养基、温度和传代间隔均不同，表明MA方法在估计突变参数方面具有良好的可重复性。本研究的科学价值在于提供了*Sc. pombe*这一重要模式生物的全基因组突变参数，并对突变偏倚、插入/缺失动态、CpG高突变性的分子机制以及MA实验的可重复性提供了新见解。
六、研究亮点
本研究的亮点包括：在无DNA甲基化的*Sc. pombe*中发现CpG位点仍然具有高突变率，且突变谱不支持甲基化胞嘧啶脱氨基假说，这提示其他物种中CpG位点的高突变性可能部分由甲基化非依赖机制引起；发现*Sc. pombe*存在强烈的插入偏倚，并导致基因组净增，提示基因组大小可能不处于平衡状态；通过与Farlow等（2015）几乎同时开展的独立研究进行系统对比，证明MA实验在不同条件下仍能获得高度一致的突变率和突变谱估计；此外，在方法学上采用祖先差异位点直接估计假阴性率，为MA研究提供了较可靠的错误率参考。