本研究由多伦多大学Donnelly细胞与生物分子研究中心的Jolanda van Leeuwen、Carles Pons、Joseph C. Mellor等共同完成，通讯作者为Chad L. Myers、Brenda J. Andrews、Frederick P. Roth和Charles Boone。论文于2016年11月4日发表在《Science》期刊上，题为《Exploring genetic suppression interactions on a global scale》。
研究背景
遗传抑制（genetic suppression）指某个基因突变造成的表型缺陷被另一个基因的突变所挽救的现象。这类遗传互作可以连接同一通路或同一生物学过程中的基因，为理解细胞功能提供新的机制性认识；也可以纠正基因表达或蛋白质合成方面的缺陷。更广泛地说，抑制互作可能在人类疾病的遗传基础中发挥重要作用，例如孟德尔疾病变异的不同外显率（penetrance）。然而，在解读个人基因组序列时仍面临巨大困难，部分原因在于我们缺乏对序列变异如何以非加性方式互作产生深刻表型（包括遗传抑制）的理解。
在酵母中，利用生长速率作为适合度指标，高通量遗传互作研究已经鉴定出数十万个负互作与正互作。负互作如合成致死（synthetic lethality）已被广泛绘制，但抑制互作尚未被系统性探索。正向互作可以进一步按强度分类：掩蔽（masking）互作中双突变体适合度高于预期但仍低于或等于最慢单突变体；而抑制（suppression）互作中双突变体比最慢单突变体更健康，甚至可能与野生型相当。大多数通过合成遗传阵列（SGA）分析发现的正互作属于较弱的掩蔽互作，而较强的抑制互作在很大程度上仍未得到探索。本研究的主要目标是研究功能性抑制的一般原理，通过整合文献筛选与系统性实验数据，构建一个全球性的抑制互作网络，以期为蛋白质功能提供新机制见解，并为生物通路的组分排序提供依据。
研究流程与结果
研究团队首先整理了已发表的文献数据。他们从BioGRID的“synthetic rescue”数据集中获取约6000个潜在互作，涉及约1700篇论文。研究人员对每个互作逐一注释了抑制子突变类型、被抑制的“query”突变类型、以及特定实验条件（如药物或特殊碳源）。排除了基因内抑制、涉及非生长表型、涉及两个以上基因的互作，以及来自高通量实验或剂量互作的条目。最终得到的文献整理网络包含1304个基因和1842个独特抑制互作。利用力导向布局对该网络进行可视化后，发现大多数query基因（69%）仅被一个或两个抑制子抑制，而少数query基因（5%）有多达10到27个报道互作。尽管网络平均度较低，但涉及高度研究过程（如DNA复制与修复、染色质与转录）的基因倾向于因子共享抑制互作而聚集在一起。例如，在DNA复制与修复子网络中，许多互作似乎代表替代DNA修复通路的激活——RAD51依赖的同源重组受损时，非同源末端连接（NHEJ）的失活可抑制毒性染色体缺失或重排。在转录相关子网络中，抑制互作主要代表转录的激活或抑制。
对抑制网络的性质进行分析，发现许多抑制互作发生在功能相关的基因之间。query突变体趋向于被注释到同一生物学过程的另一个基因抑制。抑制互作连接的基因还倾向于共表达，编码位于同一亚细胞区室或同一通路或蛋白质复合物中的蛋白质。与SGA产生的全局负遗传互作和正遗传互作网络相比，抑制网络中的功能富集程度显著更强。抑制互作还与剂量抑制网络及SGA来源的正、负遗传互作网络有显著重叠。例如，CDC25功能缺失突变体的生长缺陷可被RAS2的功能获得性突变抑制，而RAS2的功能缺失突变则加剧CDC25的生长缺陷，产生合成致死的负遗传互作。尽管存在这些重叠，78%的抑制互作是抑制网络所特有的，因此为细胞功能线路图提供了新的信息。
在系统性实验部分，研究团队利用SGA分析鉴定自发抑制子突变。SGA通常将特定natMX标记的query突变与约5000个kanMX标记的缺失突变株杂交，构建单倍体双突变体。本研究巧妙地将这一流程转化为全基因组双因子杂交扫描，以检测query菌株基因组中是否存在未标记的抑制子位点——SGA分析会显示出一组沿基因组位置连锁分布的小菌落，称为连锁群（linkage group）。研究共完成7056个全长SGA筛选，涉及5845个不同基因的缺失或亚效等位突变株。在251个SGA筛选（约4%）中鉴定出指示自发抑制子突变的连锁群。对251个候选抑制子菌株进行全基因组测序，在216个（86%）菌株中于SGA鉴定的抑制子位点内发现了突变，其中98%通过Sanger测序确认。对候选抑制子基因进行质粒互补分析和四分体分析等遗传验证，88%的抑制互作在至少一种分析中呈阳性。最终鉴定了216个自发产生的无偏突变，可抑制146个非必需基因缺失突变体和70个必需基因亚效等位突变株的生长缺陷。尽管与文献整理数据集有显著重叠，92%的系统性抑制互作此前未见报道，表明酵母遗传抑制网络在很大程度上仍未被探索。
通过对抑制强度的相对大小进行分析，发现表现出更强抑制互作的基因对在功能相关性的多种度量上显示更强的富集。这一结果说明较大幅度的适合度改善更可能由功能上与query相似的基因突变引起，而较弱的抑制可能通过更一般的机制实现。系统性网络还揭示了一个重要的抑制子枢纽：编码线粒体F1-ATP合酶α、β、γ亚基的基因突变抑制了34个线粒体翻译机制组分的query突变体以及线粒体DNA和RNA聚合酶基因的缺失等位突变。这些query突变均导致线粒体基因组丢失，进而因蛋白质输入线粒体的缺陷而生长受损。ATP合酶抑制子突变可在缺乏线粒体DNA的情况下恢复适合度和线粒体蛋白质输入。研究者提出，这些突变可能逆转ATP合酶活性，产生ADP³⁻而非ATP⁴⁻，借助电荷差异由腺嘌呤核苷酸转运子重建线粒体膜电位，从而恢复蛋白质输入。
研究者还利用抑制互作对未表征基因进行功能预测。例如，失功能突变YM010W可抑制MON2缺失突变体的生长缺陷。进一步检测发现，YM010W缺失也能抑制NEO1-2和DOP1-1ts突变体，甚至能抑制必需基因NEO1和DOP1缺失的致死性。NEO1为磷脂翻转酶（flippase）家族成员，负责将磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）从膜的外叶翻转到胞质叶，从而建立膜脂不对称性。YM010W缺失能恢复neo1-2突变体对膜结合肽papuanide A和duramycin的耐受性以及GFP-LactC2的质膜定位。研究者提出YM010W可能作为一种scramblase，双向转运PS和PE，部分抵消NEO1及其他翻转酶建立的膜不对称性。因此将该开放阅读框命名为ANY1（antagonizes Neo1 yeast phospholipid flippase）。
全基因组测序还揭示了每个抑制子菌株平均携带约8个额外的次级突变。与抑制子突变不同，这些次级突变不影响指数期细胞生长，多数为同义突变或位于基因间区，错义突变在必需基因中频率较低，预测有害性更低，较少位于蛋白质互作界面，更多位于无序区域。研究者将这些额外突变称为“过客突变”（passenger mutations）。然而，有几个基因在大量测序菌株中反复发生突变，包括WHI2、IRA1、IRA2、RIM15和UBC13，这些基因突变多为移码或无义突变，提示选择的是功能丧失。研究者通过混合群体连续传代实验证明，这些突变可能通过延迟稳定期起始而增加种群丰度，因而在实验室培养条件下被选择富集。
结论与意义
通过对抑制互作进行机制分类，54%的query被功能相关基因的突变抑制。这些功能连接可分为四类：同一蛋白质复合物成员之间的抑制（A1类）、同一通路成员之间的抑制（A2类）、不同但相关通路之间的抑制（A3类）以及共享同一生物学过程但缺乏具体通路或复合物注释的基因对（A4类）。此外，对于亚效等位基因（如必需基因的条件温度敏感等位基因），一种更为普遍的等位基因特异性抑制是通过削弱蛋白质降解或mRNA降解机制来稳定突变蛋白或mRNA。在实验数据集中，48%的亚效query被蛋白质降解或mRNA衰变基因突变抑制。总体上，60–70%的抑制互作可归入上述机制类别，而SGA鉴定的正遗传互作仅有34%，过客-query对仅有11%，表明真正的抑制互作具有高度功能与机制特异性。
本研究的科学价值在于建立了首个全球性的酵母遗传抑制网络，阐明了抑制互作的一般性原理，证明抑制互作是连接功能相关基因的强有力工具，可用于推断未知基因功能。研究还揭示了亚效等位基因通过蛋白质或mRNA稳定性调控被抑制的普遍机制，对理解基因型-表型关系具有重要启示。此外，研究发现约26%的测序菌株携带可能延迟稳定期起始的适应性突变，这一发现对解释实验室菌株的演化历史具有重要意义。从应用角度而言，该研究的思路和方法框架可推广至哺乳动物细胞和模式生物，帮助鉴定影响人类疾病外显率的修饰基因，并可能为疾病相关的query突变识别新的药物靶点。研究还提示，在人类自然群体中补偿性突变可能以较高频率存在，理解遗传抑制有助于揭示遗传变异在演化过程中如何积累，以及修饰基因如何决定包括人类疾病在内的遗传性状的严重程度。