2018年，来自韩国基础科学研究所基因组工程中心、韩国科学技术院以及首尔国立大学的Beum-Chang Kang、Jae-Young Yun、Sang-Tae Kim、Youjin Shin、Jahee Ryu、Minkyung Choi、Je Wook Woo和Jin-Soo Kim（通讯作者）等研究人员，在《Nature Plants》期刊上发表了一篇研究简报，题为“Precision genome engineering through adenine base editing in plants”。这项研究成功地将腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editors, ABEs）这一新兴的基因组精准编辑工具应用于植物体系，并首次在整体植株水平上实现了由特定碱基替换（A-to-G）所诱导的可遗传表型改变。
这项研究属于植物分子生物学与基因组编辑领域的前沿交叉。其学术背景根植于CRISPR-Cas系统在植物基因工程中的革命性应用。传统的CRISPR-Cas9核酸酶通过在靶位点产生DNA双链断裂，依赖细胞内易错修复的非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）途径，主要产生小片段的插入或缺失（Indels），从而实现基因敲除。然而，在作物改良和基础研究中，精准引入单核苷酸突变（点突变）具有同等甚至更重要的意义，例如模拟自然发生的单核苷酸多态性（SNPs）以研究基因功能，或直接创制优良农艺性状。此前，植物中点突变诱变主要依赖化学诱变（如EMS诱导的TILLING技术）或基于胞嘧啶脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine Base Editors, CBEs），它们主要实现C-to-T（或G-to-A）的转换。而由Gaudelli等人于2017年在哺乳动物细胞中开发的腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），能够高效、精确地将A-T碱基对转换为G-C碱基对，从而极大地扩展了可实现的精准编辑范围。但在该研究发表时，ABEs在植物中的应用尚未有功能性的报道，其在植物细胞中的编辑效率、特异性以及在整体植株中能否成功诱导可观察的表型变化，都是悬而未决的关键问题。因此，本研究的目标非常明确：评估并优化ABEs在植物细胞（包括原生质体和整体植株）中的功能，验证其编辑的精确性和效率，并最终通过精准的A-to-G编辑，在模式植物拟南芥中创造出可遗传的、具有明确表型（如晚花、白化）的突变体，为植物基因组工程和生物技术开辟新的途径。
研究流程详尽而系统，主要分为四个关键环节：植物兼容型ABE载体构建与原生质体瞬时转染测试、编辑特性分析（编辑窗口与序列偏好性）、农杆菌介导的拟南芥稳定转化与表型筛选、以及突变分析与遗传传递验证。
首先，研究团队构建了植物兼容的腺嘌呤碱基编辑器。他们选取了在哺乳动物细胞中表现优异的四个“后期版本”ABE（ABE6.3, 7.8, 7.9和7.10）的核心组件——工程化的大肠杆菌来源的tRNA腺苷脱氨酶二聚体（TadA dimer）。将这四个TadA二聚体分别与植物密码子优化的Cas9切口酶（Nickase）融合，构建了四个独立的植物二元表达载体，命名为pCABEs。为了测试这些pCABEs在植物细胞中的活性，他们采用了原生质体瞬时转染这一快速评估系统。分别将四个pCABE载体连同靶向拟南芥（ALS, PDS, FT, LFY基因）和甘蓝型油菜（BnALS, BnPDS基因）不同位点的单导向RNA（sgRNA）共转染到两种植物的原生质体中。经过72小时培养后，提取基因组DNA，对靶位点进行扩增子深度测序。样本量为三个生物学重复。测序数据分析使用Cas-Analyzer软件进行，以精确量化A-to-G转换效率和Indel频率。这是ABE在双子叶植物细胞中的首次功能验证。
其次，在确认pCABEs具有活性后，研究团队对编辑特性进行了深入分析。他们发现，在四个版本中，pCABE7.10的编辑效率最高，在拟南芥原生质体中A-to-G编辑频率最高可达4.1%，在油菜中可达8.8%，且Indel频率极低（<0.1%），证实了ABE的精准性。他们进一步定义了ABE在植物中的编辑窗口，发现其主要作用于protospacer序列中第5至第9位腺嘌呤（A5-A9），与在人类细胞中观察到的窗口相似。此外，他们还进行了一项新颖的分析：探究ABE是否对目标腺嘌呤（A）前的核苷酸有偏好性。通过分析多个靶位点的测序数据，并归一化处理，他们发现当目标A（如A5）之前是胸腺嘧啶（T）时（即T-A序列），A-to-G的转换效率相对更高。这一发现为未来选择高效编辑靶点提供了实用指导。同时，为了评估脱靶效应，他们利用Cas-OFFinder软件预测了针对两个靶点（AtFT, AtALS）的多个潜在脱靶位点（允许最多4个碱基错配），并通过深度测序检测，结果显示在这些位点上没有显著的脱靶编辑事件，初步表明了pCABE7.10的高特异性。
第三，研究进入整体植株水平的验证。团队选择编辑效率最高的pCABE7.10系统，通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥（Columbia-0生态型）。这里引入了一个关键的优化：他们测试了三种不同的启动子（35S, YAO, RPS5a）来驱动ABE7.10的表达。其中，RPS5a和YAO启动子被报道能在拟南芥早期发育阶段高效驱动Cas9表达。他们设计了靶向FT基因和PDS3基因的sgRNA。靶向FT基因的目的是在编码区第7位腺嘌呤（A7）引入A-to-G突变，导致蛋白质第85位酪氨酸（Y）变为组氨酸（H）（Y85H）。此前研究已知，该突变会使FT蛋白功能转变为类似TFL1蛋白的功能，可能引起晚花表型，这是一种模拟“新功能化”（neo-functionalization）的过程。靶向PDS3基因的目的是在第3内含子剪接受体位点的第6位腺嘌呤（A6）引入突变，该位点是高度保守的“AG”二核苷酸的一部分，破坏该位点预计会导致mRNA错误剪接，从而敲除PDS3功能（PDS参与类胡萝卜素合成，敲除导致白化表型）。他们分别获得了52株（35S启动子）、44株（YAO启动子）和20株（RPS5a启动子）靶向FT的T1代转基因植株。通过靶位点深度测序分析编辑效率，结果非常显著：RPS5a启动子系统的效率最高，85%的T1植株在FT靶位点的编辑效率超过50%，而35S和YAO系统未能产生高编辑效率的植株。这凸显了启动子选择对于在植物中实现高效碱基编辑至关重要。
第四，对获得的转基因植株进行表型观察和分子分析。在RPS5a-ABE系统中，他们成功获得了具有预期表型的T1植株。FT靶向的植株（如FT-#3）在长日照条件下表现出明显的晚花表型，与通过传统CRISPR-Cas9产生Indel突变导致的FT敲除植株表型一致，但前者是通过精准的单氨基酸替换实现的。PDS3靶向的植株则出现了不同程度的矮化和镶嵌式白化表型，表明白化表型在组织间呈嵌合分布，同时也说明RPS5a启动子的活性并非严格局限于早期发育阶段。对具有表型的植株进行Sanger测序和扩增子深度测序验证，确认了精准的A-to-G替换。例如，FT-#3植株在FT基因A7位点的编辑效率为84%，测序色谱图显示为清晰的单峰（T-to-C，对应DNA反义链的A-to-G）。PDS3-#4和PDS3-#5白化叶片在A6位点的编辑效率分别为52%和66%，Sanger测序显示为重叠峰。有趣的是，从同一株镶嵌白化植株的绿色叶片取样检测，也检测到了较低比例（12%-19%）的编辑，说明编辑事件在不同组织细胞中发生的程度不同。
为了确证ABE编辑的等位基因能够通过生殖细胞遗传，研究团队收集了PDS3靶向的T1植株（如#4, #5）的种子（T2代）并播种。四天后，在绿色幼苗中观察到了完全白化的T2幼苗，这些白化幼苗在生长8天后无法长出真叶，生长停滞，这与纯合PDS3基因敲除突变体的典型特征一致。对三株白化T2幼苗（T2-#1, #2, #3）进行测序分析，结果显示在PDS3的A6位点几乎完全是G碱基（效率高达98.7%-99.8%），且其他腺嘌呤位点（如A8）未发生编辑。这强有力地证明，在T1代植株中发生的ABE编辑事件成功地传递到了T2代，并且这些高编辑效率的T2植株是经过配子传递后形成的纯合或双等位基因突变体，而非在T2代新发生的编辑。
此外，为了直接证明PDS3靶向ABE是通过破坏剪接导致表型，研究团队还从白化叶片中提取RNA，进行逆转录和深度测序分析。他们发现，除了正常的251bp cDNA片段外，还存在一个247bp的片段。序列分析证实，这个较短的片段正是由于内含子剪接受体位点“AG”中的A被编辑为G后，导致剪接受体失效，从而使用了下游的一个隐秘剪接受体，产生了含有提前终止密码子的错误剪接mRNA变体，从分子机制上直接解释了白化表型的成因。
本研究的主要结论是：研究团队成功开发并优化了适用于植物的腺嘌呤碱基编辑器（pCABEs），其中pCABE7.10结合RPS5a启动子系统在拟南芥中表现出极高的编辑效率。他们首次在整体植株水平上证明了ABEs能够通过精准的A-to-G编辑，实现两种不同策略的功能获得：一是通过单氨基酸替换诱导蛋白质新功能化（FT Y85H导致晚花），二是通过破坏内含子剪接受体位点导致基因功能丧失（PDS3错误剪接导致白化）。更重要的是，这些由ABE创造的精准突变能够稳定地通过生殖系遗传给后代。
这项研究的科学价值和应用价值都非常突出。在科学上，它将哺乳动物细胞中开发的ABE技术成功拓展到植物领域，系统评估了其在植物细胞中的编辑特性（效率、窗口、序列偏好性、特异性），并首次展示了其在模式植物中创制可遗传、有表型突变体的能力，为植物功能基因组学研究提供了强大的新工具。在应用上，ABEs极大地扩展了植物精准基因组编辑的能力，使得无需引入DNA双链断裂和供体模板即可实现A-to-G的定向进化，为作物遗传改良（如优化植物抗性、产量、品质相关基因的特定氨基酸）和合成生物学元件设计提供了前所未有的精确手段。其“新功能化”的演示尤其具有启发性，表明可以通过精细的蛋白质工程来创造新的性状。
本研究的亮点在于：1. 方法学的创新与优化：首次将ABE应用于植物，并通过对启动子系统的筛选（发现RPS5a启动子效率最高），建立了高效的植物体内ABE编辑体系。2. 严谨的系统性验证：从原生质体瞬时表达、编辑特性分析，到稳定转化、表型观察、分子验证（Sanger测序、深度测序、RNA-Seq验证剪接异常），再到遗传传递分析，形成了一个完整、闭合的证据链。3. 概念验证的深度：不仅证明了编辑可行，更通过两个精妙设计的案例（FT的氨基酸替换和PDS3的剪接破坏），展示了ABE在植物中实现“精准”编辑的两种截然不同的应用场景（功能获得与功能丧失），并都获得了可遗传的表型。4. 对编辑特性的新发现：首次在植物体系中观察到ABE可能对T-A序列具有编辑偏好性，这一发现具有实用指导意义。
值得一提的是，在本文审稿期间，另有其他研究组也报道了ABE在植物（水稻）中的应用，但主要聚焦于分子水平的编辑验证。本文与之相比，不仅提供了更全面的编辑模式分析，更重要的是首次提供了ABE编辑导致可遗传表型改变的直接证据，并深入探究了其背后的分子机制（如错误剪接），从而将植物ABE研究从“可行”推进到了“可用且有效”的新阶段，为植物基因组工程和生物技术开辟了新的道路。