本研究由南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新利用全国重点实验室的韩晓旭、殷娟、焦雪莹、胡若琳、张英杰、陈发杭、董彪、程春燕、王昱辉、陈进风、娄群峰，以及湖南农业大学园艺学院的王春华、吴涛等研究人员共同完成。研究成果以题为“A mutation in CsBRP1, encoding a PHD-type domain-containing protein, causes semi-dwarfism in cucumber (Cucumis sativus L.)”的原始研究论文形式，于2026年发表于学术期刊《theoretical and applied genetics》（第139卷，第98期）。

本研究属于植物遗传学与分子生物学交叉领域，旨在探索黄瓜株型调控的分子机制。株型是决定作物生物量分配和产量形成的关键农艺性状，矮化或半矮化品种能够提高种植密度、光能利用效率和抗倒伏性，对于现代农业发展具有重要意义。此前，在水稻、小麦等作物中发现的矮化基因（如水稻的*sd1*基因）引领了第一次“绿色革命”。黄瓜作为一种重要的葫芦科蔬菜作物，其蔓生习性、节间长、无限生长等特性限制了高密度种植，增加了管理成本。因此，选育理想株型（如半矮化）的黄瓜品种是育种家的重要目标。尽管已有一些调控黄瓜矮化的基因被鉴定，涉及细胞分裂素、油菜素内酯、赤霉素等激素途径以及F-box蛋白、LRR激酶等，但多数突变体伴随其他生长发育性状的改变。近年来研究表明，表观遗传修饰（如组蛋白修饰）在作物生长发育中扮演关键角色。PHD（Plant Homeodomain，植物同源结构域）是一种锌指结构域，能够特异性识别组蛋白修饰（如H3K4me3），作为“组蛋白密码阅读器”调控基因表达。然而，PHD结构域在葫芦科作物株型调控中的作用尚不清楚。基于此，本研究旨在从一个EMS（乙基甲烷磺酸盐）诱变的黄瓜突变体库中，鉴定一个新型半矮化突变体，并克隆其致病基因，解析其功能及作用机制，以期为黄瓜乃至葫芦科作物的株型改良提供新的基因资源和理论依据。

详细研究流程如下：

1. 突变体筛选与表型鉴定： * 研究对象与样本量： 研究以自交系“长春密刺”（CCMC）黄瓜为野生型对照，从其EMS诱变库中筛选得到一个稳定的半矮化突变体，命名为sd。 * 处理与实验： 将sd与CCMC进行正反交，获得F1代，通过自交和回交构建F2和BC1分离群体。在人工气候室和南京农业大学白马黄瓜研究站田间，系统测量并比较了sd与CCMC在整个生育期的表型，包括株高、节间数、节间长度、下胚轴长度、叶片大小、叶色、叶柄角度、花器官及果实大小等。同时，利用扫描电子显微镜（SEM）和石蜡切片技术，观察并测量了sd与野生型植株第二节间表皮细胞和薄壁细胞的长度和面积，以从细胞水平解析矮化原因。 * 数据分析： 进行统计学分析（每个处理至少5株，3次生物学重复），并通过卡方检验分析F2和BC1群体的表型分离比，以确定该性状的遗传模式。

2. 基因定位与候选基因鉴定： * 研究对象与样本量： 利用sd与CCMC杂交构建的F2分离群体。首先，从中分别选取27株极端矮化个体和29株野生型表型个体，混合构建突变体池（aa）和野生型池（AA/Aa）用于BSA-seq（基于集群分离分析的测序）。随后，使用243个个体的F2群体进行初步定位验证，并进一步将群体扩大至454个个体用于精细定位。 * 处理与实验： * BSA-seq： 提取两个混池的DNA，利用Illumina HiSeq PE150平台进行全基因组重测序。将测序数据比对到黄瓜参考基因组“Chinese long v3”，使用BWA、Samtools、GATK等软件进行SNP（单核苷酸多态性）和Indel（插入缺失标记）的检测与过滤。 * 遗传图谱构建与精细定位： 根据CCMC和sd之间的多态性序列，开发SNP和Indel标记。基于BSA-seq分析得到的候选区间，设计均匀分布的分子标记，对F2群体进行基因分型。通过分析重组个体的表型和基因型，逐步缩小候选区间。最终，利用开发的dCAPS（衍生切割扩增多态性序列）标记，在扩大群体中筛选重组单株，将目标区域限定在最小区间内。 * 数据分析： 计算δ(SNP-index)值，通过滑动窗口法（1 Mb窗口，10 kb步长）在全基因组范围定位与性状显著关联的区间。在精细定位区间内，结合EMS诱变偏好性（G→A或C→T转换），筛选在突变体池中SNP-index为1且导致非同义突变的SNP，从而确定候选基因。

3. 候选基因克隆与生物信息学分析： * 处理与实验： 根据精细定位结果，对候选基因进行克隆和测序。通过PCR扩增包含突变位点的cDNA片段，并进行Sanger测序验证突变。利用SMART等在线工具预测候选基因编码蛋白的结构域。从Cucurbit Genomics Database v2和NCBI数据库中搜索黄瓜及其他物种中的同源蛋白序列。 * 数据分析： 使用ClustalW进行多序列比对，使用MEGA 11.0软件通过邻接法构建系统发育树，分析蛋白序列的保守性和进化关系。

4. 基因功能验证： * 研究对象： 拟南芥T-DNA插入突变体*atbrp1*（SALK_021560）和黄瓜野生型CCMC。 * 处理与实验： * 拟南芥突变体表型分析： 对*atbrp1*突变体进行基因型鉴定（采用三引物PCR策略），并与野生型Col-0比较其莲座叶大小、开花时间等表型。 * 病毒诱导的基因沉默（VIGS）： 采用苹果潜隐球形病毒（ALSV）载体系统。将黄瓜CsBRP1基因PHD结构域的特异性片段（373 bp）构建到ALSV的RNA2载体（pALSV2）上，获得pALSV2-CsBRP1载体。同时，以八氢番茄红素脱氢酶基因（CsPDS）作为指示标记构建pALSV2-CsPDS。将上述载体与辅助质粒pALSV1共同转化农杆菌GV3101。通过真空渗透法侵染萌发的CCMC种子，获得基因沉默植株。 * 数据分析： 利用qRT-PCR检测沉默植株中CsBRP1的表达水平。在侵染后不同时间点（如20天和45天）系统测量沉默植株和对照植株的株高、节间长等表型，进行统计学比较。

5. 基因表达模式与转录组分析： * 研究对象与样本量： 分别采集sd和CCMC在开花期的根、茎、叶、雄花、子房、卷须等组织，每个样品至少3株混合，设3个生物学重复。同时，采集开花期顶部第一片完全展开叶，用于转录组测序（RNA-seq），设3个生物学重复。 * 处理与实验： * qRT-PCR： 提取各组织总RNA，反转录为cDNA，以CsActin2为内参基因，检测CsBRP1在不同组织中的表达水平。 * RNA-seq： 提取叶片总RNA，由上海派森诺生物技术股份有限公司利用Illumina HiSeq平台进行150-bp双末端测序。 * 数据分析： qRT-PCR数据采用2−ΔΔCt法计算相对表达量。RNA-seq数据经过质控后，使用HISAT2比对到黄瓜参考基因组（“Chinese long” v4.0），使用StringTie计算基因表达量（FPKM）。使用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs，阈值：p < 0.05，|log2(Fold Change)| > 1）。对DEGs进行GO（Gene Ontology，基因本体论）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）通路富集分析，以探究突变影响的生物学过程和代谢通路。特别关注与组蛋白修饰、激素合成与信号转导相关的DEGs。

本研究取得的主要结果如下：

1. 表型与遗传分析结果： sd突变体在整个生育期表现出稳定的半矮化表型，与CCMC相比，株高降低约24.8%，节间显著缩短，叶片变小、叶色深绿、叶柄角度减小使株型更紧凑，但育性正常（图1）。细胞学观察发现，sd节间变短主要由表皮细胞和薄壁细胞长度缩短导致，而非细胞数目减少（图1D-G）。遗传分析表明，F1代株高与野生型无异，F2群体中野生型与突变体分离比符合3:1（χ² = 0.002, P=0.966），BC1群体符合1:1（χ² = 1.991, P=0.158），证明该性状由单隐性核基因控制。这一结果为后续的基因定位提供了明确的遗传学基础。

2. 基因定位与克隆结果： BSA-seq分析在3号染色体12.36 Mb至16.23 Mb区间检测到一个显著的δ(SNP-index)峰值，初步将候选区间定为4.27 Mb（图2A）。通过分子标记对F2群体进行连锁分析，将区间缩小至438 kb，进一步利用扩大的群体和dCAPS标记，最终将区间精细定位到标记snp6-1和snp6-3之间的183.7 kb区域（图2B， C）。该区间内共注释有23个基因。结合EMS突变特征（G→A）和突变体池测序数据分析，发现唯一一个位于基因编码区且导致非同义突变的SNP（snp3g15432719）。该SNP位于基因Csav3_3g019540的第一个外显子上，突变（G1604A）导致色氨酸（W）密码子变为终止密码子（W535*）（图2D，图S2）。因此，将该基因确定为候选基因。

3. 候选基因特性分析结果： 该基因全长13,371 bp，包含6个外显子，编码一个含1,943个氨基酸的蛋白。同源性分析显示，该蛋白与拟南芥的BRP1（At3g15120）同源性最高（45%），因此将其命名为CsBRP1。蛋白结构预测表明，CsBRP1包含一个AAA+型ATP酶结构域和一个PHD结构域。sd突变中的提前终止密码子导致翻译出的蛋白被截断，完全丢失了C端的PHD结构域（图3A）。系统发育分析显示，CsBRP1在不同植物中高度保守，其PHD结构域包含典型的C4HC3锌结合基序（图3B， D）。对拟南芥同源基因*AtBRP1*的T-DNA插入突变体表型分析发现，*atbrp1*突变体也表现出植株矮小、莲座叶变小的表型（图4D-F），这初步证明了BRP1基因功能的跨物种保守性，并暗示其在黄瓜中可能具有类似的调控功能。

4. 基因功能验证结果： 为了直接验证CsBRP1的功能，研究采用ALSV-VIGS技术，特异性靶向沉默黄瓜野生型CCMC中CsBRP1的PHD结构域编码区。qRT-PCR结果显示，在侵染后20天，多个独立沉默株系（如si-1, si-2等）中CsBRP1的表达量显著下降（图5E）。至侵染后45天（藤蔓伸长期），这些沉默植株表现出明显的节间缩短和株高降低，平均株高比对照降低约26%，与sd突变体的表型高度相似（图5A-D）。虽然随着植株生长沉默效率有所下降，但CsBRP1的表达量仍维持在对照的约50%左右（图5F）。这一结果有力地证明了CsBRP1，特别是其PHD结构域，对于维持黄瓜正常的节间伸长和株高至关重要，其功能缺失直接导致半矮化表型。

5. 表达模式与转录组分析结果： qRT-PCR显示，CsBRP1在野生型黄瓜的茎、叶、雄花、子房中表达较高。在sd突变体中，根、茎、叶和雄花中的CsBRP1表达量显著降低，但在子房和卷须中变化不显著（图6A）。这可能是由于突变导致蛋白功能丧失，引发了转录水平的反馈调节。RNA-seq分析在sd与CCMC叶片中鉴定出4,731个DEGs（2,258个下调，2,473个上调）（图6B）。富集分析发现，上调的DEGs 主要富集在核糖体生物发生、DNA复制、RNA转运等通路（图6C, D）；下调的DEGs 则显著富集于植物激素信号转导（尤其是生长素信号通路）、MAPK信号通路等（图6E, F）。进一步分析显示，多个生长素响应因子（如ARFB, ARF18, ARF19）和Aux/IAA家族成员（如IAA3, IAA8等）在sd中表达下调。同时，多个组蛋白修饰相关基因在sd中表达上调，包括组蛋白甲基转移酶（如ATXR6, ATX2）、组蛋白乙酰转移酶（如HDT1）以及核心组蛋白（H2A, H2B, H3.1, H4）的编码基因（图6G）。这些转录组数据为解析CsBRP1的作用机制提供了重要线索。

本研究的结论是： 本研究成功从一个EMS诱变的黄瓜群体中鉴定了一个新型半矮化突变体*sd*，并通过图位克隆技术确定其致因为CsBRP1基因第一个外显子的单碱基突变（G→A）。该突变导致翻译提前终止，产生一个缺失PHD结构域的截短蛋白。功能验证表明，CsBRP1的PHD结构域对于黄瓜正常株高的维持是必需的。转录组分析提示，CsBRP1的功能缺失可能通过影响组蛋白修饰状态，进而下调生长素等激素信号通路相关基因的表达，最终导致细胞伸长受阻和植株矮化。因此，CsBRP1可能作为一个连接表观遗传修饰（组蛋白阅读）与激素信号转导的枢纽，调控黄瓜的株型发育。

本研究的科学价值与应用价值在于： 首先，CsBRP1是首个在黄瓜中被报道的、通过PHD结构域调控株高的基因，将表观遗传调控因子（组蛋白密码阅读器）与黄瓜株型发育直接联系起来，拓展了对葫芦科作物株型建成分子网络的理解，具有重要的科学价值。其次，该研究为黄瓜半矮化育种提供了一个新的、有潜力的候选基因（CsBRP1）。与一些导致极端矮化或伴随其他不良农艺性状的突变基因相比，*sd*突变体在显著降低株高、改善株型的同时保持了正常育性，展示了其在培育适宜高密度种植、减少田间管理成本的黄瓜新品种方面的应用潜力。最后，研究采用的ALSV-VIGS技术体系为黄瓜基因功能快速验证提供了有效工具。

本研究的亮点包括： 1. 新颖的基因功能： 发现了PHD结构域蛋白CsBRP1在黄瓜株型调控中的新功能，连接了表观遗传阅读与植物激素信号，机制新颖。 2. 系统深入的研究流程： 从突变体发现、表型精细鉴定、遗传分析、图位克隆、生物信息学分析、跨物种功能验证（拟南芥）、本物种功能丧失验证（VIGS）到转录组机制探索，构成了一套完整、严谨的功能基因研究范式。 3. 明确的育种应用潜力： 鉴定出的*sd*突变体表型明确（半矮化、紧凑、育性正常），其因果基因CsBRP1可作为分子标记辅助选择或基因编辑的靶点，用于黄瓜理想株型的定向改良。 4. 高质量的数据支撑： 研究综合利用了BSA-seq、精细定位、RNA-seq等多种高通量测序技术，数据详实，结论可靠。

本研究不仅克隆并功能验证了一个调控黄瓜半矮化性状的关键基因CsBRP1，还初步揭示了其可能通过整合表观遗传和激素信号途径来调控植株生长的分子框架，为黄瓜分子设计育种提供了新的基因资源和理论指导。