关于明确蛋白质折叠途径的论述：一篇基于实验的范式审视
本文由S. Walter Englander与Leland Mayne共同撰写，两位作者均来自美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的生物化学与生物物理系约翰逊研究基金会（the Johnson Research Foundation, Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania）。该文以《明确蛋白质折叠途径的论证》（the case for defined protein folding pathways）为题，于2017年8月1日发表于《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences, PNAS）第114卷第31期。
本综述文章的核心主题是，针对蛋白质折叠这一生物学基础过程，系统性地对比、分析和评判了当前两种主流的理论模型：一是源自理论推演的“多途径模型”（many-pathway model），或称“新视角”（New View）模型；二是基于大量实验证据的“明确途径模型”（defined-pathway model）。文章旨在通过梳理和评估现有实验数据，回答蛋白质折叠领域的几个根本性问题：蛋白质如何折叠？为何以这种方式折叠？其折叠途径的信息如何编码在一维氨基酸序列中？
文章首先指出，尽管自C. B. Anfinsen证明蛋白质可自发折叠以来已过去五十多年，但关于折叠机制的核心问题仍无普遍共识。“能量景观理论”（Energy Landscape Theory, ELT）衍生出的多途径模型认为，蛋白质通过无数条微观的、异质性的途径，在氨基酸残基水平上进行动力学搜索，最终抵达能量最低的天然态。该模型假设能量漏斗的形状提供了偏向天然相互作用的“偏向力”，但这种偏向力如何在物理化学层面具体实现，始终是一个未解之谜。
与此相对，文章详尽阐述了基于“折叠子”（Foldons）概念的明确途径模型。该模型源于一系列实验发现，构成了本文论证的主体。
主要论点一：蛋白质由称为“折叠子”的协同结构单元组装而成，其折叠遵循基于折叠子的明确、逐步途径。
这一论点得到多种实验方法，尤其是氢交换（Hydrogen Exchange, HX）相关技术的强有力支持。氢交换-核磁共振（HX-NMR）和氢交换-质谱（HX-MS）等技术能够探测在平衡态下或动力学折叠过程中瞬时存在的部分折叠中间体结构。
- 支持证据与论述：
- 平衡态折叠子识别：早期对细胞色素c（Cyt c）的HX-NMR研究发现，在天然条件下，蛋白质会以低概率可逆地部分去折叠，形成一系列能量阶梯状的部分去折叠形式（Partially Unfolded Forms, PUFs）。每个PUF对应于一个或多个协同去折叠的结构单元，这些单元被鉴定为“折叠子”。例如，Cyt c可被分解为蓝色、绿色、黄色、红色等折叠子（参见原文图1b）。根据微观可逆性原理，这一阶梯式去折叠过程暗示，折叠可能沿相反顺序、以逐步方式发生。
- 动力学途径的直接观测：新兴的HX-MS脉冲标记技术，能够实时、高分辨率地监测动力学折叠过程。该方法将处于去折叠状态的蛋白质快速转入折叠条件，在不同折叠时间点施加短暂的氘-氢交换脉冲来标记未保护（未折叠）的区域，随后通过质谱分析肽段保护模式。对RNase H蛋白的研究（原文图2）提供了决定性证据：数据显示，整个蛋白质群体以高度协同的方式，按明确的顺序（先是蓝色折叠子，然后是绿色、黄色、红色）依次折叠。每个肽段的质谱信号呈现双峰分布，表明相应片段在特定时间点从“未保护”到“完全保护”发生 concerted 转变，排除了大量分子以不同顺序折叠的可能性。
- 其他蛋白质的佐证：文章列举了多种其他蛋白质的实验结果支持同一模型，包括：麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein）形成天然态中间体；Bai等人对脱辅基细胞色素b562（Apocytochrome b562）定义了折叠子依赖的序列折叠途径；Georgescauld等人对TIM桶蛋白（DapA）在分子伴侣GroEL内的折叠研究；以及对脱辅基肌红蛋白（Apomyoglobin）、脱辅基黄素氧还蛋白（Apoflavodoxin）、OspA蛋白、葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease）、β-三明治FHA结构域等的研究。这些来自不同实验室、使用不同方法（HX、突变分析、硫基反应性等）的工作共同验证了折叠子作为天然结构协同构建模块的普遍性，以及其决定的逐步折叠途径的存在性。
主要论点二：所谓的“多途径”行为仅存在于折叠初期前成核阶段，且缺乏功能意义和能量基础，无法驱动后续结构形成。
文章承认并分析了在多途径模型框架下预测的微观轨迹多样性，但通过审视关键实验，对其重要性提出根本性质疑。
- 支持证据与论述：
- 单分子实验的解读：Ritchie, Woodside等人利用高时间分辨率的单分子力谱（光学镊子）成功观测到了单个蛋白质分子在折叠过程中的许多动态转变轨迹。这些研究确实检测到了折叠初期的多条微观路径（Transition Paths）。然而，文章指出对这些数据的解读至关重要：
- 速率的一致性：无论是单体朊蛋白的折叠时间分布（原文图3b），还是二聚体朊蛋白初始折叠步骤的过渡路径时间分布（原文图3e），都完美符合单一指数衰减，表明整个分子群体以一个均一的速率常数进行折叠或跨越能垒。观测到的路径时间差异属于单一速率过程内的随机涨落，而非代表具有不同速率的异质分子群体。
- 目标的明确性：对于二聚体朊蛋白，尽管初始步骤存在微观路径的多样性，但所有分子都抵达同一个明确的部分折叠中间态，并随后通过明确的后续中间态继续折叠。
- 能量学上的不可能性：文章引用Zwanzig等人的计算指出，为了使折叠在合理时间内完成，偏向正确（天然）相互作用的自由能偏倚必须达到约2 kT（1.2 kcal/mol），而焓偏倚需更大。已知的氨基酸残基间相互作用能通常小于1 kcal/mol，因此在残基水平上，其能量差异不足以在大量非天然相互作用的竞争海洋中有效地选择天然相互作用。能量景观理论声称这种偏倚存在于漏斗形状中，是“最小挫败”（minimal frustration）进化的结果，但这被文章批评为缺乏具体的物理化学解释。
- 与结构形成阶段实验的矛盾：文章强调，HX-MS等能够解析折叠中间体结构的技术，在多个蛋白质的结构形成阶段均未检测到显著的、可替代的平行途径。如果存在大量异质途径，不同分子折叠特定片段的顺序和速率应不同，实验应能观测到更复杂的、非协同的信号，但事实并非如此。
主要论点三：折叠子模型天然地解决了能量偏倚和信息编码问题，其协同性提供了足够的选择性能量，且可能与蛋白质进化密切相关。
这是文章为明确途径模型提供的更深层理论基础和演化解释。
- 支持证据与论述：
- 能量问题的解决：折叠子模型在更宏观的层次上运作。每个折叠子的形成，涉及多个残基间协同的、立体化学上接近天然态的相互作用的总和。这种协同作用将许多微弱残基相互作用的能量集体加和，从而能够产生达到甚至超过Zwanzig计算所需门槛的显著能量偏倚，以在每一步稳定正确的（折叠子级别）结构并选择正确的组装顺序。
- 信息编码的一致性：在折叠子模型中，决定蛋白质最终天然结构的同一套协同相互作用（立体化学和能量），也自然地编码了其逐步折叠的途径。折叠途径信息并非来自抽象的能量景观形状，而是内嵌于蛋白质三维结构模块化的组织方式本身。
- 进化角度的合理性：文章提出，模块化的折叠子结构与逐步折叠策略可能协同进化而来。现代重复蛋白（Repeat Proteins）的研究为此提供了线索。重复蛋白由小的（20-40个残基）、协同的重复单元线性排列而成，这些单元本身就像折叠子，且被证明以一次一个或几个重复单元的明确步骤折叠。推测早期蛋白质从这些小片段通过重复复制和融合进化而来，从而将其固有的模块化折叠特性遗传给了现代球蛋白。这种基于折叠子的设计和折叠策略，因其能有效解决复杂的折叠难题（将大问题分解为一系列小问题）而被自然选择保留并广泛采用。
结论与意义
本文的最终结论是，大量直接、可重复的实验证据强有力地支持了基于折叠子的明确途径蛋白质折叠模型。该模型不仅得到了多种蛋白质和多种实验技术的验证，而且在物理化学（协同性能量偏倚）、信息编码（结构决定途径）和进化起源方面提供了连贯、具体的解释。相比之下，源自能量景观理论的多途径模型，虽然在描述折叠初期的微观涨落上有其观察基础，但无法解释后续结构形成的明确性和专一性，其依赖的“能量漏斗偏倚”机制缺乏具体的物理化学实现方案，被视为一种不够充分的解释。
本文的价值和意义在于： 1. 系统综述与批判性分析：文章对蛋白质折叠领域两大竞争范式进行了全面、清晰的梳理和对比，并基于实验数据进行了有力的论证，试图澄清长期存在的争议。 2. 强调实验基石：作者明确主张，在这样一个复杂领域，应更坚定地立足于“实验的坚实根基”，而非无数不确定的推演和假设。 3. 提供统一框架：明确途径模型将蛋白质的静态结构（由折叠子组装）、动态折叠途径和能量驱动原理统一在一个简洁的框架内，对理解蛋白质折叠、错误折叠、设计及相关的生物学和医学问题具有根本性的指导意义。 4. 连接进化与功能：将折叠子结构与折叠途径的起源与蛋白质进化联系起来，为理解蛋白质结构与功能的演化增添了新的视角。