本研究由Xiaoling Dai、Derun Quan、Libao Wang、Di Cui、Xihe Wan与Qian Ren共同完成。其中，Xiaoling Dai、Derun Quan和Libao Wang为并列第一作者，Di Cui、Xihe Wan和Qian Ren为通讯作者。研究单位包括南京信息工程大学海洋科学学院（中国江苏南京）、菏泽学院农业与生物工程学院（中国山东菏泽）、南京师范大学海洋科学与工程学院（江苏省水生动物绿色高效养殖技术工程研究中心）、以及南通市海洋与渔业研究所（中国江苏南通）。该研究成果于2023年12月13日在线发表于学术期刊《Fish and Shellfish Immunology》第144卷，文章编号109286。
本研究属于甲壳动物免疫学与病毒学交叉领域。其开展具有深刻的学术背景与现实需求。首先，转录因子Forkhead box O (FoxO)在从线虫到哺乳动物的多种生物中均高度保守，参与调控DNA修复、细胞周期、代谢、免疫等多种生命过程。然而，在无脊椎动物，特别是经济甲壳动物中，FoxO在抗病毒先天免疫（Innate Immunity）中的具体功能与调控机制尚不清晰。其次，白斑综合征病毒（White spot syndrome virus, WSSV）是水产养殖中危害最严重的病原之一，感染对虾、蟹等多种甲壳动物，引起白斑病（White spot disease, WSD），造成全球虾类养殖业每年高达数十亿美元的经济损失。目前尚无有效的治疗方法，因此，深入解析宿主对抗WSSV的先天免疫防御机制，对于开发新型防控策略至关重要。脊尾白虾（*Exopalaemon carinicauda*）是中国东部混养模式中的重要经济物种，具有生长快、繁殖力强、环境适应性强等特点，是研究甲壳动物免疫的良好模型。本研究的主要目的，即是从脊尾白虾中鉴定FoxO同源基因（命名为EcFoxO），探究其在WSSV感染过程中的表达模式，并阐明其如何通过与另一个关键免疫转录因子Relish相互作用，调控抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs）的表达，从而参与宿主的抗病毒免疫防御。
本研究的工作流程系统而严谨，主要包含以下几个步骤： 第一，EcFoxO基因的克隆与生物信息学分析。 研究人员首先从脊尾白虾中获得了EcFoxO的全长cDNA序列（GenBank登录号：OR822344）。该序列全长2382 bp，开放阅读框（ORF）长1713 bp，编码570个氨基酸。利用生物信息学工具进行分析：通过SMART工具预测蛋白质结构域；通过BLAST和DNAMAN进行同源序列比对与相似性分析；使用MEGA 6.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joining method）构建基于氨基酸序列的系统进化树，以确定EcFoxO在进化上的位置。本研究所采用的实验方法均为该领域常规技术，如总RNA提取、cDNA合成、PCR克隆、序列比对及系统发育分析等，未涉及特殊发明的实验方法或算法。
第二，EcFoxO在WSSV感染下的表达模式分析。 此步骤旨在探究EcFoxO是否响应WSSV感染。研究对象为健康的脊尾白虾（体重1.0 ± 0.2 g）。实验分组为WSSV感染组和对照组（注射PBS）。感染方式为每尾虾注射100 μL含有WSSV（约10^7 copies mL^-1）的PBS缓冲液。在感染后的0、24、48、72、96小时，分别随机采集三尾虾的肝胰腺（Hepatopancreas）和鳃（Gills）组织。总RNA提取使用商业试剂盒，cDNA合成使用带有gDNA去除步骤的反转录试剂盒。采用实时定量PCR（RT-qPCR）技术检测EcFoxO mRNA的表达水平，以18S rRNA作为内参基因。每个样本设置三个技术重复，相对表达量采用2^(-ΔΔCt)方法计算，统计学差异使用双尾非配对t检验进行评估，P < 0.05视为具有统计学显著性。
第三，RNA干扰（RNAi）敲低EcFoxO，并检测其对AMPs及Ecrelish表达的影响。 此步骤旨在探究EcFoxO的功能及其与下游基因的关系。首先，体外合成针对EcFoxO的双链RNA（dsRNA），并以绿色荧光蛋白（GFP）的dsRNA作为阴性对照。每尾虾分两次注射共计30 μg的特异性或对照dsRNA（间隔24小时）。在第二次注射dsRNA 24小时后，对虾进行WSSV攻击（方法同上）。在WSSV攻击24小时后，采集虾的鳃组织。通过RT-qPCR检测以下指标：1) EcFoxO的敲低效率，以确认干扰成功；2) 一系列抗菌肽基因的表达水平，包括3种抗脂多糖因子（ALF1-3）、4种甲壳素（Crustin, Cru1-4）和4种溶菌酶（Lysozyme, Lyso1-4）；3) 另一个免疫转录因子Ecrelish的表达水平。所有检测均以注射GFP-dsRNA并感染WSSV的组作为对照。
第四，RNA干扰敲低Ecrelish，并检测其对AMPs及EcFoxO表达的影响。 此步骤旨在反向验证EcFoxO与Ecrelish之间的调控关系。实验流程与第三步类似，但敲低的目标基因换为Ecrelish。同样合成Ecrelish-dsRNA和GFP-dsRNA，进行注射和WSSV攻击。采集鳃组织后，通过RT-qPCR检测：1) Ecrelish的敲低效率；2) 上述同一系列AMPs基因的表达水平；3) EcFoxO的表达水平。以注射GFP-dsRNA并感染WSSV的组作为对照。
本研究所获得的主要结果环环相扣，有力地支撑了最终结论： 在生物信息学分析中，结果显示EcFoxO蛋白包含一个典型的叉头（Forkhead, FH）DNA结合结构域和多个低复杂度区域。系统进化分析表明，EcFoxO与罗氏沼虾（*Macrobrachium rosenbergii*）等甲壳动物的FoxO聚类在一起，亲缘关系最近。多重序列比对显示，其FH结构域的氨基酸序列在甲壳动物间高度保守，相似性达83.60%。这些结果证实了从脊尾白虾中成功克隆到了一个保守的FoxO转录因子。
在表达模式分析中，得到了一个有趣的组织特异性结果：在WSSV感染后，肝胰腺中EcFoxO的表达量在24小时有所下降；然而，在鳃组织中，EcFoxO的表达量则在感染后的24、48、72和96小时均显著上调。这一差异表明，EcFoxO的免疫调控功能可能具有组织特异性，在作为主要免疫器官之一的鳃中，EcFoxO被WSSV感染显著诱导，提示其可能参与鳃组织的抗病毒免疫反应。这为后续的功能研究聚焦于鳃组织提供了依据。
在EcFoxO功能缺失研究中，结果非常明确。首先，注射EcFoxO-dsRNA成功将鳃组织中EcFoxO的表达敲低了约60%，证明了RNAi的有效性。关键的发现是，敲低EcFoxO后，在WSSV感染的背景下，大部分检测的AMPs基因表达显著降低。具体而言，EcALF1、EcALF3、EcCru1、EcCru3、EcCru4以及全部四种溶菌酶（EcLyso1-4）的表达均受到显著抑制。这直接证明了EcFoxO对于维持WSSV感染期间多种AMPs的高水平表达是必需的，即EcFoxO正调控（positively regulates）这些免疫效应分子的表达。更进一步的发现是，敲低EcFoxO同时也显著降低了Ecrelish的表达水平。这首次暗示了在脊尾白虾中，FoxO与Relish这两个关键免疫通路（可能指胰岛素/FOXO通路和IMD/Relish通路）的转录因子之间存在调控联系。
在反向验证实验中，结果完美地呼应并补充了上述发现。敲低Ecrelish同样成功，并导致了类似的结果：多种AMPs（ALF1,3; Cru1-4; Lyso2-4）的表达水平显著下降。这证实了Ecrelish同样正调控AMPs的表达。而最有力的证据是，敲低Ecrelish后，EcFoxO的表达量也出现了显著下降。结合第三步中敲低EcFoxO会降低Ecrelish表达的结果，这清晰地表明，在脊尾白虾遭受WSSV感染时，EcFoxO和Ecrelish能够相互正调控对方的表达，形成了一个正反馈调控环（positive regulatory loop）。
基于以上结果，本研究得出明确结论：在脊尾白虾中，转录因子EcFoxO参与了对WSSV感染的先天免疫应答。它通过与另一个转录因子Ecrelish构成一个正反馈互作环路，协同上调一系列抗菌肽（AMPs）的表达，从而增强宿主清除病毒、抵御感染的能力。这一发现揭示了FoxO在甲壳动物抗病毒免疫中一种新的调控机制。
本研究的科学价值与应用意义重大。在科学层面，它首次在脊尾白虾中鉴定了FoxO基因并阐释了其免疫功能，丰富了我们对FoxO转录因子在无脊椎动物，特别是甲壳动物免疫调控网络中作用的认识。更重要的是，它揭示了FoxO与NF-κB家族成员Relish之间存在正反馈互作，这是一种新颖的免疫通路交叉对话（crosstalk）机制，为理解先天免疫网络的复杂性和协同性提供了新的视角。在应用层面，该研究增进了对WSSV-宿主互作机制的理解，所发现的EcFoxO/Ecrelish/AMPs调控轴可作为潜在的分子靶点，为未来通过营养调控（如调节胰岛素信号）、基因选育或免疫增强剂开发等策略，提高养殖虾类的抗病能力，防控白斑病提供了理论依据。
本研究的亮点突出：首先，在研究发现上，不仅证实了FoxO能调控抗菌肽表达这一在昆虫中已知的功能在甲壳动物中同样存在，更关键的创新在于发现了FoxO与Relish之间的正反馈互作机制，这是该研究最重要的理论贡献。其次，在研究设计上，采用了“基因鉴定-表达分析-功能缺失（RNAi）-反向验证”的完整逻辑链条，实验设计严谨，证据相互支撑，结论可靠。特别是通过双向RNAi实验，有力证明了EcFoxO与Ecrelish的相互调控关系，而非单向作用。最后，在研究对象上，聚焦于具有重要经济价值的脊尾白虾和毁灭性病原WSSV，使得研究工作既具有基础理论探索价值，又紧密结合产业实际需求。
此外，研究中观察到的EcFoxO在肝胰腺和鳃中响应WSSV感染的表达模式差异，也是一个有价值的发现，提示FoxO的免疫调控功能可能具有组织环境依赖性，这为后续更精细的细胞或组织特异性功能研究指明了方向。文末详细列出了所有使用的引物序列，为其他研究者的重复实验或进一步研究提供了便利，体现了研究的规范性和可重复性。