本研究由Ann yesha Biswas、Zoe Weiss、Jack W. Szostak和Saurja Dasgupta等人完成。其中，Ann yesha Biswas和Saurja Dasgupta来自美国圣母大学化学与生物化学系及生物科学系，Zoe Weiss来自哈佛医学院/麻省理工学院MD-PhD项目，Jack W. Szostak来自芝加哥大学化学系及霍华德·休斯医学研究所。该研究发表于*Nature Communications*期刊，2026年第17卷，文章编号5634，DOI为10.1038/s41467-026-74622-8。
核酶（ribozyme）被认为在原始RNA生命中发挥了关键作用，催化代谢过程并促进基因组复制。通过体外进化（in vitro evolution）技术，研究者已大幅拓展了对RNA催化能力的认识，发现了多种自然界中不存在的核酶化学活性。RNA连接酶（ligase）是核酶多样性的典型代表，它们能够催化RNA底物5′端活化的磷酸基团与另一RNA的2′-羟基、3′-羟基或5′-磷酸基团之间的连接反应。然而，在定向进化实验中，常常会出现具有意外功能的核酶——它们利用非预期的反应途径通过选择压力而富集。本研究即报道了这样一种意外发现的核酶连接酶活性：连接反应发生在核酶自身的5′-三磷酸基团（5′-triphosphate, 5′-ppp）与RNA底物的2′-羟基之间，但仅当底物在亲核性2′-羟基的邻位（vicinal）具有3′-磷酸基团时才能发生。该发现不仅揭示了RNA的新催化活性，还为理解核酶进化、原始RNA修复机制以及RNA测序应用提供了新视角。
本研究始于一项体外进化实验，该实验最初旨在从部分随机化的RNA文库中分离能够以5′-三磷酸化RNA为底物的连接酶核酶。文库源自已表征的“磷酰咪唑连接酶”（AIP连接酶）RS1，其40个核苷酸区域以每个位点21%的比例进行了突变。选择构建体中包含一段8核苷酸的“引物”序列，通过六尿苷连接子与核酶主体相连，该引物的末端核苷酸即为预期的连接位点。文库RNA与含有5′-三磷酸基团和3′-生物素标签的16核苷酸RNA底物孵育，具有连接活性的序列通过链霉亲和素磁珠捕获、RT-PCR扩增和体外转录进行富集。经过6轮选择后，高通量测序分析显示，五个最丰富的序列簇（命名为CS1至CS5）占整个选择群体的90%以上。
对这五个序列的活性测试表明，CS1、CS2、CS4和CS5表现出对底物3′端生物素化状态的意外依赖性，而CS3则催化预期的三磷酸连接酶反应。研究者随后选择活性最高且最丰富的CS1进行详细的生化表征。通过截短实验、5′端化学修饰实验（分别将核酶5′端设为三磷酸、单磷酸或羟基）以及底物5′端修饰实验（三磷酸、单磷酸、羟基或倒置双脱氧胸苷阻断），确定了核酶5′-三磷酸基团是底物亲核攻击的靶点，而底物的5′端并不参与反应。进一步将底物末端核糖核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，证实了底物末端2′-羟基是亲核基团。双外切酶消化实验（5′→3′ Terminator外切酶和3′→5′ RNase R）证实，产物中存在非经典的2′-5′磷酸二酯键。
关于3′端修饰依赖性，研究者通过一系列实验排除了生物素作为辅因子的可能性，并证实真正的要求是底物3′端的磷酸基团（3′-phosphate）或磷酸二酯基团。CS1对含3′-磷酸的底物连接速率比背景反应快超过5个数量级。研究还发现CS1、CS2、CS4和CS5均具有此活性，表明它们属于一类新的连接酶。通过硫代磷酸酯底物和Cd²⁺金属离子拯救实验，研究者发现Mg²⁺与底物3′-磷酸基团之间存在较弱的内层配位相互作用。SHAPE化学探测结合计算预测揭示了这些核酶可能的二级结构，TurboFold分析提示CS1、CS2和CS4可能共享一个共同的结构折叠。
CS1催化的连接反应在缺乏外部模板时仅降低3倍速率，表明该反应不依赖于模板。5′端截短使核酶失活，而3′端截短仅降低8倍活性，说明核酶5′端直接参与反应。只有携带5′-三磷酸的CS1具有活性，而底物5′端的化学修饰（三磷酸、单磷酸、羟基）对反应速率无显著影响，kobs均约为1.5 h⁻¹。底物5′端被倒置双脱氧胸苷阻断后仍能连接，确证了底物5′端不参与反应。将底物末端腺苷酸替换为脱氧腺苷酸后连接完全消失，证明底物末端2′-羟基是亲核基团。外切酶消化实验最终确认产物中存在2′-5′磷酸二酯键。
CS1无法连接含2′,3′-顺式二醇的底物，但补充游离生物素不能拯救活性；将生物素从3′端移至5′端会消除连接，而将生物素替换为去硫生物素则保留活性。删除生物素与3′-磷酸之间的TEG间隔子也不影响连接。关键在于，仅含3′-磷酸基团而无生物素的底物（substrate-3′p）能以与生物素化底物相当的速率连接。这些结果证明，CS1类连接酶的实际需求是底物3′端的磷酸基团。与含3′-磷酸单酯底物和含3′-磷酸二酯底物均能连接的事实排除了3′-磷酸作为广义碱催化剂的可能。金属离子实验表明，Mg²⁺与底物3′-磷酸之间存在弱相互作用，可能有助于在活性位点定位催化性二价金属离子。硫代磷酸酯底物在Cd²⁺存在下连接速率恢复2.5倍，进一步支持了这一观点。
尽管CS1不依赖外部模板，但CS2、CS4和CS5需要外部模板才能发挥活性。研究者发现这些核酶的3′端引物序列与模板之间存在功能性碱基配对，模板突变消除连接，而核酶3′端的补偿性突变可恢复活性。这表明模板通过与核酶3′端和底物5′端同时碱基配对，使三组分反应接近分子内反应，从而促进连接。
SHAPE探测和TurboFold预测显示CS1、CS2和CS4可能共享共同的二级结构折叠，其中包含一段保守的碱基配对茎（5′-CCACUCA-3′与3′-GGUGAGU-5′）。CS5的预测结构则有所不同，但也包含一个缩短的相应茎结构（5′-CUCA-3′与3′-GAGU-5′）。在缺乏高分辨率结构的情况下，研究者谨慎地指出这些连接酶之间可能存在结构相似性，但尚不能确定。
CS1对3′-磷酸化RNA底物表现出高亲和力（Km = 0.165 μM）和高催化效率（kcat/Km = 27.65 μM⁻¹h⁻¹）。在60倍过量大肠杆菌tRNA混合物中，CS1能特异性捕获5′FAM标记的3′-磷酸化靶RNA，且连接产物的荧光信号在0.05至0.4 μM范围内与底物浓度呈线性关系。CS1对末端碱基表现出偏好性：末端腺苷酸是最佳底物，末端鸟苷酸连接速率慢约500倍，末端胞苷酸和尿苷酸则几乎不被连接。类似地，核酶5′端必须是鸟苷酸，突变后所有四种核酶均丧失活性。研究还证明，含2′,3′-环状磷酸的RNA经温和酸处理后转化为3′-磷酸，即可被核酶捕获。所捕获的RNA即使在3′-磷酸未去除的情况下也能被逆转录和PCR扩增。
本研究报道了一类新型核酶连接酶，它们催化自身5′-三磷酸基团与RNA底物2′-羟基之间的连接反应，但严格要求底物在2′-羟基的邻位具有3′-磷酸基团。这一活性与蛋白质RNA修复连接酶（如tRNA连接酶和RtcB连接酶）的机制相似，提示在RNA世界中，类似核酶可能通过连接被切割的RNA片段参与基因组修复。该发现还表明，单一选择压力可以同时富集多种催化功能，进一步凸显了RNA作为催化分子的多样性。
在应用方面，这些核酶对3′-磷酸化RNA具有绝对的特异性，可用于从细胞总RNA中选择性富集切割产物。这对于转录组学研究中探测RNA切割产物（尤其是含末端磷酸基团的RNA）具有重要意义。含2′,3′-环状磷酸的RNA也可通过简单的酸处理转化为可捕获形式。这些核酶有望发展为RNA测序的富集试剂，用于在健康和疾病状态下绘制细胞RNA切割图谱，并可能发现新的疾病生物标志物。
本研究的突出之处在于：（1）在定向进化实验中意外发现了一种全新的核酶催化活性——需要底物3′-磷酸的2′-5′连接反应；（2）该活性与现有生物学中蛋白质RNA修复通路存在机制上的相似性，为RNA世界的基因组修复假说提供了实验支持；（3）核酶对3′-磷酸化RNA具有绝对选择性，可作为新型RNA富集试剂应用于转录组学研究；（4）发现了底物末端碱基偏好性和核酶5′端鸟苷酸约束，提示存在内部模板或特定活性位点结构。
研究还发现，CS1在含高浓度Mg²⁺（100 mM）和2AI活化底物的条件下可产生多聚体RNA产物，这些产物的骨架包含2′-5′和3′-5′磷酸二酯键的混合连接。这表明该核酶能在长转录本背景下发挥作用。研究者在讨论中还提出了一个原始RNA修复模型：RNA切割产生的5′片段含2′,3′-环状磷酸，经酸水解转化为3′-磷酸后成为核酶连接酶底物；而3′片段的5′-羟基则可通过Muller实验室报道的三磷酸化核酶在环三偏磷酸盐存在下转化为5′-三磷酸，从而完成连接修复。这一模型为早地球RNA生命维持基因组完整性提供了一条化学上可行的途径。