华南农业大学生命科学学院刘耀光团队在《Journal of Genetics and Genomics》发表了一项改进的高效热不对称交错PCR（modified high-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR, mhiTAIL-PCR）技术的研究成果。该研究由谭建涛、龚奇等共同完成，于2019年5月29日在线发表，旨在解决传统基因组步移（genome walking）技术中长片段侧翼序列扩增效率低下的问题。

学术背景

在分子生物学研究中，克隆已知区域相邻的未知侧翼序列（flanking sequences）对基因功能分析、转基因整合位点鉴定等至关重要。传统方法如反向PCR（inverse PCR）和连接介导PCR（ligation-mediated PCR）操作复杂且成本较高，而基于随机引物的TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）虽简化了流程，但受限于DNA聚合酶活性和简并引物（degenerate primers）效率，扩增产物通常短于1.5 kb。刘耀光团队此前开发的hiTAIL-PCR虽提高了成功率，但仍无法满足长片段扩增需求。因此，本研究通过优化引物设计、引入新型扩增策略和高保真酶，开发了mhiTAIL-PCR方法。

研究流程与技术细节

1. 引物系统创新

研究团队设计了4种改良的长简并引物（modified long arbitrary degenerate primers, mLADs），其特点包括：
- 降低简并度：5-9位含576倍简并度（原LAD为1024倍），减少错配；
- 抑制自配对：通过限制3’端两个位点为三核苷酸（而非四核苷酸）避免引物二聚体；
- 共用5’尾巴序列：29 nt的GC-rich序列（GC含量62.1%）作为后续扩增引物AC0/AC1的结合位点，并产生抑制PCR效应（suppression-PCR effect）。

2. 三步扩增流程

预扩增阶段：
- 线性富集：先用特异性引物（如RB-0A）进行10轮高严谨性循环，生成目标单链；
- 锚定结合：1轮低严谨循环（25°C）使mLAD与侧翼序列结合，引入AC0/AC1位点；
- 指数扩增：25轮常规PCR，以AC0（Tm 58-60°C）替代mLAD作为扩增引物，优先扩增长片段。

初级与次级TAIL-PCR：
- 抑制短产物：利用AC1（Tm 50-52°C）和带24 nt尾巴的特异引物（如RB-1A）形成发夹结构，抑制短片段（ kb）扩增；
- 嵌套引物增强特异性：次级PCR采用内引物（如RB-2A）进一步富集目标产物；
- 热循环优化：交替使用高严谨和低严谨循环（tail-cycling），减少非特异扩增。

3. 酶学优化

采用Phanta Max超保真DNA聚合酶（Vazyme），其长片段扩增能力显著优于传统Ex Taq酶（Takara），产物长度可达3-4 kb（图1c/d）。

实验结果

在72个转基因水稻（紫胚乳稻和虾青素稻）的测试中：
- 成功率：95.8%（69/72），与hiTAIL-PCR相当；
- 产物长度：使用Phanta酶时达3-4 kb，Ex Taq酶则限制在2 kb内；
- 特异性：所有测序产物均含目标T-DNA侧翼序列（图S3）。

结论与价值

mhiTAIL-PCR通过三大创新——mLADs引物、AC0预扩增策略和高保真酶系统，实现了长片段侧翼序列的高效克隆。其科学价值在于：
1. 技术突破：解决了PCR-based genome walking的片段长度限制；
2. 应用广泛性：适用于任何生物的未知序列克隆，尤其适合转基因整合分析；
3. 高通量适配：配套96孔板方案可批量处理样本。

研究亮点

• 引物设计革新：mLADs通过可控简并度和自配对抑制提升效率；
  
• 双重抑制机制：发夹结构抑制短产物，嵌套引物降低背景噪音；
  
• 酶学选择关键性：首次明确Phanta酶对长片段扩增的不可替代性。
  

该研究为基因组编辑、转基因鉴定等领域提供了高效工具，相关引物设计和实验方案已通过补充材料公开，具有较高的方法学推广价值。