基于Ptychographic EUV Imaging的微生物高分辨化学成分成像研究

这篇研究文章以“Visualizing the Ultra-Structure of Microorganisms Using Table-Top Extreme Ultraviolet Imaging”为题，发表在Photonix期刊2023年第4卷第6期，由Chang Liu等人及其团队完成。本文主要作者和单位包括Friedrich-Schiller-University Jena（耶拿大学应用物理研究所及其Abbe光子学中心）、Helmholtz-Institute Jena、GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung等。研究聚焦于利用基于高次谐波（High Harmonic Generation, HHG）的台式超紫外光（Extreme Ultraviolet, EUV）成像技术，对微生物的超微结构以及化学成分进行高分辨成像。这项研究实现了该技术在台式条件下的首次深度应用，揭示了其在生物学成像领域的潜力。

学术背景及研究目标

这项研究属于生物成像（biological imaging）的交叉领域，涉及光学、X射线显微技术和电子显微技术（Electron Microscopy, EM）等的探索和发展。微生物成像在制药学、医学和基础生命科学研究中起着至关重要的作用，现有的多种显微成像手段，如光学显微镜（Optical Microscopy）、硬X射线显微镜（Hard X-ray Microscopy）和透射电子显微镜（Cryo-EM），在分辨率、化学对比度或样本穿透深度等方面各有优势，但也具有技术限制。例如，硬X射线对全细胞成像的吸收对比度较低，而电子显微镜中的电子穿透深度不足。

本文的创新点在于利用EUV光谱区域的特性进行生物成像。13.5纳米波长的EUV光能够提供很高的元素对比，同时具有适度的穿透深度，能够解析亚细胞级别的结构信息。本研究目的是通过HHG驱动的Ptychography（位置相关的衍射图像成像）技术，探索其在微米级厚度样本中的成像能力以及化学成分分布的分析能力。

研究流程及方法

本研究主要分为实验装置设计、样本制备及成像测量三大部分，其研究对象包括两个种类的生物样本：菌丝真菌Aspergillus nidulans和细菌Escherichia coli（大肠杆菌），具体方法如下：

1. 实验装置及光源设计
   本研究构建了一个基于高次谐波的EUV光源，其核心由一台定制化的高功率、超短脉冲纤维激光器组成。该激光器工作于1030纳米波长，通过光纤脉冲展宽和几何调制技术实现7飞秒的脉冲宽度，产生功率高达30瓦，重复频率为75kHz的激光脉冲。随后，通过聚焦入700微米直径的氩气喷射流中，进一步生成宽带EUV连续谱，波长为13.5纳米附近。

设计中特别应用了多层膜反射镜和带孔掩膜以增强成像分辨率。掩膜形状为螺旋结构，用以提升光照的频谱优势，为Ptychographic重建提供丰富的空间频率信息。

1. 样本制备与防处理
   样本制备过程中，真菌Aspergillus nidulans的孢子在特定培养基中培养16小时后被洗净并固定于50纳米厚的Si3N4膜上。大肠杆菌样本K12株培育在LB培养基中，随后被冲洗并干燥。这些样本未经染色或化学处理，尽力保持内部功能单位的原始形态，但细胞脱水会在一定程度上影响其大小及化学分布。

2. IR与EUV成像的结合
   研究中采用了红外（IR）和EUV双波长的联合成像策略，以解决小视野（FOV）的问题。红外光（1030纳米）提供大视野、低分辨率的样本概览图，帮助确定感兴趣区域（ROI）；随后在13.5纳米波长的EUV下对这些区域进行高分辨率扫描。IR扫描中样本视野达到0.9平方毫米，分辨率约为1-2微米；而EUV扫描则细化到58纳米的空间分辨率。

3. 图像重建与分析
   采用Ptychography技术对扫描数据进行重建，生成复杂传输图像（包括振幅与相位的复数信息）。分析中引入了“散射比”（Scattering Quotient）这一参数，其通过光学厚度与化学组成的结合，揭示了样本中不同区域的化学成分分布特性。数据分析使用了先进的混合态重建公式和交错探针松弛算法（Orthogonal Probe Relaxation, OPR），以提升算例的准确性与降低伪影。

研究主要结果

1. 真菌样本成像与分析
   在Aspergillus nidulans的成像中，成功显示了菌丝的内部结构，特别是菌丝尖端区域可识别出“尖端小体”（Spitzenkörper）。通过散射比图像的分析，该尖端小体显示出高磷脂浓度，与其作为生长活动中心的已知生物角色相吻合。此外，样本的细胞壁成分被确认为以碳水化合物为主，支持细胞壁主要由葡聚糖构成的文献数据。

2. 细菌样本成像与分析
   对Escherichia coli样本的高分辨成像揭示了其细胞分裂过程中的亚细胞结构。在细胞中部区域，散射比表明存在核酸（DNA/RNA）、蛋白质及脂类。低散射比的边缘区域则被认定为细胞壁，成分以碳水化合物为主。

3. 散射比参数的化学分析
   研究通过散射比定量比较了不同区域的化学组成，为区分碳水化合物、磷脂、蛋白质、脂类和其他核酸提供了可靠方法。这种分析为生物样本内亚细胞单位的功能分区和化学分布提供了直接证据。

研究结论与价值

本研究证明了基于HHG的EUV Ptychographic成像在生物学领域的巨大潜力。与传统的X射线显微镜和电子显微镜相比，该技术具有以下优势： - 高对比度与低辐射损伤：EUV提供了比X射线更高的相位和振幅对比，同时辐射剂量低于电子显微成像的损伤阈值。 - 样本制备简单：可以直接对非染色干燥样本进行成像，最大限度保留其化学和结构信息。 - 高分辨率与化学敏感性：在无需染色的情况下，提供60纳米以下的空间分辨能力，并实现高动态范围的化学组成解析。 - 台式化设备：相比依赖同步辐射光源的传统方法，该台式化方案可大大提高技术的可及性，有望应用于生命科学和临床环境。

研究亮点与创新

• 首次实现台式化HHG-Ptychographic高分辨生物成像，具备广泛推广前景。
• 引入散射比作为化学组成分析的关键参数，提升了对亚细胞功能单位及其分布的认知能力。
• 多模态联合：通过IR与EUV联合实现大视野与高分辨的结合，为精细成像提供强大工具。

通过本研究，作者团队展示了EUV成像在生物学领域的非凡技术优势，并为未来泛化至其它多模态成像方案（如非线性显微镜、共焦显微镜等）提供了技术基础。这为生命科学家提供了一种全新的、高效的工具，用以探索微观世界的结构与功能。