本研究由 Angelica Feurdean（主要作者及通讯作者，隶属于德国法兰克福歌德大学自然地理系）与 Roxana Grindean（共同第一作者，隶属于罗马尼亚克卢日-纳波卡巴比什-博雅伊大学）领衔，联合 Gabriela Florescu、Diana Hanganu 和 Ioan Tanţău 等研究人员共同完成。该研究论文题为“Coprophilous fungal spores in modern lowland agropastoral ecosystems of eastern-central Europe reflect herbivore grazing pressure”，已于2025年在学术期刊 Vegetation History and Archaeobotany 上发表。
本研究属于古生态学与孢粉学领域，特别是关注非花粉孢粉体（NPP） 中嗜粪真菌孢子（Coprophilous Fungal Spores， 简称 CFS） 的应用。食草动物（包括野生与家养）在塑造植被动态和维持开放生态系统方面扮演着关键角色。然而，量化过去的放牧强度一直是个挑战。CFS因其依赖于动物粪便生长且能在沉积物中长期保存，被广泛用作重建古食草动物存在和活动的生物指标。尽管已有研究使用CFS（尤其是*Sporormiella*型孢子）追踪大型食草动物历史，但CFS的多样性及其与现代放牧压力（强度）和食草动物密度的定量关系，尤其是在欧洲低地农业生态系统中的系统评估，尚存诸多空白。这些空白包括：1）古记录中通常仅鉴定少数几种CFS，大量多样性被忽略；2）CFS与特定食草动物粪便类型、放牧强度之间的诊断关系不明确；3）环境因素（如栖息地湿度、季节、孢子传播过程）对CFS产量和保存的影响复杂；4）缺乏标准化的鉴定与定量方法。
因此，本研究旨在通过对罗马尼亚东部-中欧低地农业生态系统进行系统性采样，首次在欧洲低地背景下，建立现代CFS组合与放牧活动之间的校准关系。具体目标包括：1）识别与放牧活动相关的常见CFS类型或组合；2）探索是否有特定CFS组合与特定食草动物类群相关；3）调查CFS丰度与食草动物生物量（即放牧压力）之间的关系；4）评估环境驱动因子（如植被类型、气候）和传播过程对CFS生产、保存和分布的影响。最终，研究希望为利用沉积物中的CFS更精确地重建过去食草动物放牧压力（grazing pressure regime）提供依据。
本研究的工作流程严谨，分为六个主要步骤：
第一步：研究区域选择与样品采集。 研究人员选择了罗马尼亚两个具有显著牲畜放牧历史的低地区域：东南部的奥尔特纳湖（Lake Oltina） 地区和东北部的克里谢什蒂湿地（Cristeşti wetland） 地区。共采集了40个表层样品，覆盖了多种基质和季节，以捕捉CFS组合的变异性。具体而言： * 奥尔特纳地区：分两次采集。第一次于2016年秋季采集了28个样品，包括苔藓包（n=2）、表层土壤（n=25）和干牛粪（n=1），覆盖了以湖泊为中心、半径20公里范围内不同植被群落（如不同湿度、不同放牧强度的草地、废弃农田、橡树-鹅耳枥林）。第二次于2024年夏季补充采集了牧场土壤（n=1）、绵羊粪（n=2，干、鲜各一）、牛粪（n=1，干）以及沿湖泊边缘至中心的横断面表层湖相沉积物（n=5，间距约600米），用于研究CFS在大型湖泊中的传播与沉积。 * 克里谢什蒂地区：于2024年春季一次性采集了12个表层样品。其中包括围栏内（n=4）和非围栏（n=3）牧场样品、湿地边缘及中心样品（n=3），以及取自羊圈附近的苔藓样品（n=1）和废弃牧场样品（n=1）。 所有样品均详细记录了GPS位置、周围植被类型，并利用植被组成和粪肥存在情况，为每个采样点建立了从0（无放牧）到4（过度放牧）的半定量放牧强度指数。同时，从官方渠道获取了采样点所在村庄的牲畜（牛、马、绵羊、山羊）普查数据，用于计算单位面积牲畜密度（头/公顷），作为放牧压力的另一个参考指标。
第二步：样品实验室处理与孢子提取。 样品处理遵循标准的孢粉分析流程，旨在提取和富集包括CFS在内的真菌孢子，同时尽量减少处理过程对脆弱孢子（如薄壁孢子）的破坏。具体步骤包括： 1. 化学处理：使用10% HCl和10% NaOH去除碳酸盐和有机物。 2. 筛分：通过250微米筛网去除大颗粒，对于部分土壤样品额外使用10微米筛网去除粘土，以提高样品纯度。 3. 重液浮选：使用氯化锌（ZnCl₂）或聚钨酸钠进行密度分离，以分离出较轻的有机质（包含孢子和花粉）。 4. 添加示踪剂：在处理前，向每个1立方厘米的沉积物样品中添加已知数量的石松（Lycopodium）孢子片剂，以便后续计算真菌孢子的绝对浓度（粒数/立方厘米）。 本研究特别强调了方法学细节：尽管使用的10微米筛网可能损失极小的孢子（如*Sporormiella*型），但旨在平衡去除粘土与保留小孢子；同时，避免使用醋酸酐水解（acetolysis），以减少化学处理对孢子保存状态的影响，这对于提高鉴定准确性至关重要。
第三步：孢子鉴定、计数与定量。 在光学显微镜下对提取物进行鉴定和统计。 * 鉴定：依据多个权威的非花粉孢粉体鉴定图谱和数据库进行，包括van Geel 等人、Shumilovskikh 等人以及Cugny 等人的工作。鉴定基于孢子的形态特征（如大小、形状、壁厚、隔膜、萌发孔等），并使用“类型（-type）”术语，表示与某个真菌属形态相似的孢子，例如Sordaria-型、Sporormiella-型。研究详细记录了包括专性嗜粪、兼性嗜粪以及非嗜粪但与环境相关的真菌孢子（如指示土壤扰动的*Glomus*）在内的多种类型。 * 计数与定量：每个样品至少统计300粒陆生花粉或100-150粒石松示踪孢子。CFS的丰度采用两种方式表达：1）百分比：a) 占真菌孢子总和（fungal sum）的百分比；b) 占（真菌孢子+陆生花粉）总和的百分比。2）绝对浓度：基于添加的石松孢子数量和样品体积计算得出。这种双重定量方式便于评估不同表达方法的优劣。
第四步：环境与放牧压力数据整合。 将每个采样点的CFS数据与其对应的放牧强度指数（0-4）、植被类型（按湿度梯度：旱生、中旱生、中生、湿生；按土地利用：草地、废弃地、森林）、采样季节（春、夏、秋）以及单位面积牲畜密度进行关联。
第五步：数据分析。 运用了多种统计和可视化方法来揭示模式： 1. 主成分分析（PCA）：分析所有样品中真菌孢子组合（包括CFS和其他真菌）的总体变异，并探讨其主要变异轴与环境/放牧梯度（如放牧强度、湿度）的关联。 2. 稀疏化分析（Rarefaction analysis）：评估不同生境或放牧强度下的CFS多样性（丰富度）。 3. 箱线图与散点图：直观展示关键CFS类型（如Sordaria, Podospora, Sporormiella, *Delitschia*）的丰度（百分比和浓度）沿放牧强度梯度、植被湿度梯度的变化趋势。绘制散点图探索总CFS浓度、关键类型CFS浓度与放牧强度指数、牲畜密度之间的潜在关系。
第六步：与古记录对比及建议提出。 研究人员通过文献回顾，将本研究得出的现代CFS组合特征（优势类型、与环境的关系）与已发表的欧洲古生态记录中常用的CFS类型进行比较，评估当前古研究中CFS使用的充分性与局限性，并在此基础上为未来的古生态研究提出具体建议。
CFS多样性、优势类型及其分布模式：
CFS丰度与放牧强度的关系：
CFS的传播与沉积：
主成分分析与真菌组合：
与现代及古记录的比较：
本研究首次系统评估了中-东欧低地农业生态系统中现代嗜粪真菌孢子组合与放牧压力之间的关系，并得出以下核心结论： 1. 可靠的放牧压力指示剂：Sordaria-型、Podospora-型、Sporormiella-型和Delitschia-型是反映放牧压力和/或食草动物密度的稳健指标，其中*Sordaria*和*Sporormiella*的丰度常在高强度放牧下达到峰值。其他如*Arnium*、*Apiosordaria*、*Cercophora*、*Chaetomium*、*Coniochaeta*、*Gelasinospora*等类型的共现，也能可靠指示放牧环境。*Glomus*是高强度放牧引起土壤扰动的有力标记。 2. 定量重建的挑战与建议：直接定量重建食草动物绝对密度仍很困难，主要受动物活动性、孢子传播和沉积过程、局部富集效应（如聚集地）等因素影响。在量化方法上，推荐使用CFS的绝对浓度或相对于真菌孢子总和的百分比，而非相对于花粉总和的百分比，以避免花粉输入量波动的干扰。 3. 环境因子的重要性：CFS的丰度和组成受栖息地湿度和采样季节的强烈影响，潮湿生境和春季条件更利于孢子生产和保存，在未来解释古记录时必须考虑古环境背景。 4. 多指标综合：结合放牧指示植物花粉（如长叶车前、菊科） 与CFS组合，可以显著增强对东-中欧低地地区过去放牧制度重建的可信度。 5. 对古生态学的启示与建议：研究强调了当前古生态研究中CFS使用的不足，并提出了未来改进方向：a) 拓宽使用的CFS类型范围，充分利用其多样性；b) 持续更新并标准化鉴定规程和命名，以增强不同研究间的可比性；c) 探索CFS与特定粪便类型的更精细关系；d) 考虑结合其他代理指标（如粪类脂生物标志物、高通量测序）进行交叉验证和更精确的溯源。