本研究由四川农业大学（Sichuan Agricultural University）的詹晓旭（Xiaoxu Zhan）、孔凡磊（Fanlei Kong）、袁继超（Jichao Yuan）等学者与中国农业科学院都市农业研究所光生物学研究中心的研究人员共同完成，发表于《The Crop Journal》2024年第12卷，文章在线发表日期为2024年11月17日。论文通讯作者为袁继超，研究依托农业农村部西南作物生理生态与耕作重点实验室开展，受国家重点研发计划粮食丰产科技创新项目资助。
该研究属于作物生理学与分子生物学交叉领域，聚焦玉米茎秆木质纤维素（lignocellulose）生物合成的关键酶与调控基因。玉米茎秆中的木质素（lignin）和纤维素（cellulose）含量与植株抗倒伏性、抗病性、饲料品质及乙醇转化效率密切相关。在玉米六叶期（V6）之后，基部节间开始伸长并积累木质纤维素，这一过程受相关酶和基因的调控。然而，在自然田间条件下，木质纤维素合成的关键酶、重要MYB转录因子及其动态变化规律尚不明确。为此，研究选取了木质纤维素含量和抗倒伏性差异显著的五个玉米品种作为试验材料，开展了为期两年的田间试验，系统研究了V6期后地上第3和第5节间中木质素与纤维素含量的动态积累规律、相关酶浓度变化以及基因表达水平变化，旨在鉴定木质素与纤维素生物合成的关键酶和关键基因，阐明酶浓度与基因表达之间的动态关系，并确定木质纤维素合成的关键调控时期。
在研究方法与流程上，该研究分为多个相互关联的环节。首先是田间试验设计与样品采集。试验于2018年和2019年在四川农业大学温江试验站进行，采用完全随机区组设计，三次重复。2018年参试品种为XY1171、ZH6、ZH505和YHD6，2019年以抗倒伏性和木质素含量更高的RB9替换ZH6。种植密度为每公顷52500株，田间管理按当地常规农艺措施执行。自V6期后14天开始取样，此时第5节间开始伸长，取样间隔为7天，持续至吐丝期（R1）后14天。每次每小区选取6株代表性植株，去除叶鞘后截取第3和第5节间，80°C烘干至恒重，粉碎过筛后测定木质素和纤维素含量。纤维素含量采用蒽酮比色法（anthrone colorimetric method）测定，木质素含量采用改良Sancho半定量法测定。由于单位长度木质纤维素含量受非结构性碳水化合物转运影响较小，且与节间机械强度和抗倒伏性相关性更高，研究以单位节间长度的木质素和纤维素含量作为主要度量指标。
其次是木质纤维素合成相关酶浓度的测定。取样方法与上述一致，从第3和第5节间中部切取约2厘米长的新鲜组织，液氮速冻后粉碎并在-80°C保存。采用酶联免疫吸附测定试剂盒（ELISA）分别测定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonia-lyase，TAL）、咖啡酸3-O-甲基转移酶（caffeic acid 3-O-methyltransferase，COMT）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase，AOMT）、肉桂酰辅酶A还原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD）和纤维素合成酶（cellulose synthase，CE）的浓度。酶浓度同样以单位节间长度表示，以适应后续力学与积累分析的需要。研究的一个特色在于以酶浓度而非酶活性作为研究指标，理由包括：酶蛋白的翻译受基因表达直接调控，酶浓度与基因表达之间的相关性可能更强；在正常生理条件下，大多数酶蛋白处于激活状态，其功能与其数量显著正相关；酶浓度的测定条件比酶活性的测定条件更易保持酶蛋白的自然结构与功能。
第三是基因相对表达水平的检测。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，测定了五个MYB转录因子基因（ZmMYB2、ZmMYB8、ZmMYB31、ZmMYB39和ZmMYB42）、咖啡酸-O-甲基转移酶基因（ZmCOMT）以及纤维素合成酶基因（ZmCESA8和ZmCESA10）的相对表达量。RNA提取使用MiniBEST通用RNA提取试剂盒，cDNA合成使用NovoStart Plus一步法cDNA合成预混液，内参基因为actin，采用2⁻ΔΔCt法计算基因相对表达量。
第四是数据建模与统计分析。木质素含量、纤维素含量及其相关酶浓度的动态变化采用Logistic方程拟合，获得快速积累起始时间（t1）、结束时间（t2）及快速积累持续期（t）等参数。采用Rees代谢控制分析方法计算各木质素合成酶的浓度控制系数（concentration control coefficient，CCC），以鉴定木质素生物合成途径中的关键酶。同时采用相关系数-通径系数法（Ming Daoxu法）和多元线性回归平方和法（Johnson法）计算各酶和MYB基因对木质素含量的贡献率。方差分析使用SAS 9.4软件进行，相关和回归分析使用Origin 9.0软件完成。
研究获得了多项重要结果。在木质素和纤维素积累动态方面，第3和第5节间中单位长度木质素含量（LC）和纤维素含量（CC）在V6期后逐步增加，并在R1期后趋于稳定，整个过程符合Logistic模型。第3节间LC和CC的快速积累期约在V6期后20天启动，持续约13天；第5节间则约在V6期后25天启动，持续约11天。品种间比较显示，RB9和XY1171的LC和CC显著高于其他品种，而YHD6显著低于其他品种，RB9和XY1171的LC分别比YHD6高81.62%和67.47%，CC分别高59.49%和51.68%。
在酶浓度动态方面，所有品种的木质素和纤维素合成酶浓度在V6期后开始上升，约在R1期达到峰值后逐渐下降，且在V6期后35天以内不同品种间差异显著，尤其以V6期后14天差异最为突出。酶浓度的快速积累起始时间约比木质纤维素含量的快速积累起始时间早7天，快速积累持续期与木质纤维素含量基本一致，表明酶蛋白的积累先于木质纤维素的积累。相关分析显示，在V6期后14天，各木质素合成酶浓度与LC含量呈极显著正相关，而CE与CC也呈极显著正相关，说明V6期后14天是木质纤维素合成的关键调控期。
在关键酶鉴定方面，通过CCC分析和两种贡献率计算方法，综合结果表明COMT、TAL和PAL在木质素合成过程中的作用大于CCR、CAD和AOMT。其中TAL的贡献率在Johnson法计算中高达65.6%，COMT和PAL的累计贡献率也较高，三种酶的总贡献率达到72.1%。这表明COMT、TAL和PAL是玉米茎秆木质素合成的关键酶。
在基因表达方面，ZmCOMT、ZmCESA8和ZmCESA10的相对表达量在V6期后14天达到峰值，随后快速下降并趋于稳定，且其表达水平与相应酶浓度呈极显著正相关，相关系数分别为0.925、0.830和0.871。在两种纤维素合成酶基因中，ZmCESA10与CE浓度的相关性更强，表明参与次生细胞壁合成的ZmCESA10对节间总纤维素含量的贡献可能大于参与初生细胞壁合成的ZmCESA8。在MYB转录因子方面，ZmMYB8和ZmMYB39表达量与LC呈正相关，ZmMYB31和ZmMYB42表达量与LC呈负相关，ZmMYB2的负调控作用不明显。在五个MYB基因中，ZmMYB31对木质素合成酶浓度的贡献率最高，约为40%，表明ZmMYB31可能是玉米木质素合成中的关键负调控因子，而ZmMYB39和ZmMYB8可能作为正调控因子发挥作用。
综合以上结果，研究构建了玉米节间木质纤维素生物合成模型，明确了COMT、TAL和PAL为木质素合成的关键酶，ZmCOMT和ZmCESA10分别为木质素和纤维素合成的重要基因，ZmMYB8、ZmMYB31和ZmMYB39在木质素合成调控中发挥关键作用，其中ZmMYB31可能是关键抑制因子，ZmMYB39和ZmMYB8可能是激活因子。此外，V6期后14天左右是调控第3至第5节间木质纤维素合成的关键时期。
该研究的科学价值在于首次在自然田间条件下动态揭示了玉米基部节间木质纤维素合成过程中酶浓度与基因表达的协同变化规律，弥补了以往研究多关注酶活性而忽视酶浓度的不足，为理解玉米茎秆木质纤维素的生理调控机制提供了新视角。其应用价值在于，所鉴定的关键酶和关键基因可作为高木质纤维素含量品种选育的分子标记或遗传改良靶点，而V6期后14天这一关键调控期的确定则为田间管理措施（如施肥、化控等）的精准实施提供了理论依据，有助于提高玉米的抗倒伏性、抗病性以及秸秆的饲料和能源化利用效率。研究的亮点包括：以酶浓度为核心指标并结合代谢控制分析方法鉴定关键酶，采用多品种、多年份的田间试验设计增强了结论的可靠性，以及将酶动力学、基因表达与木质纤维素积累三者相结合进行整合分析的方法学特色。此外，研究还指出，关于与这些酶相关的重要中间代谢产物的动态变化仍需进一步研究，这将有助于更全面地阐明玉米茎秆木质素合成的生理机制。