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本研究题为“Microgels for Effi cient Protein Purification”，由 Boaz Mizrahi、Silvia Irusta、Marshall McKenna、Cristina Stefanescu、Liron Yedidsion、Myatnoe Zin Myint、Robert Langer 和 Daniel S. Kohane 等研究者完成，研究单位涉及 Harvard Medical School、Massachusetts Institute of Technology (MIT) 和 University of Zaragoza 等知名机构，文章于2011年发表于《Advanced Materials》。

研究背景与目的

该研究领域属于生物化学与材料科学的交叉领域，特别是涉及蛋白质分离纯化技术的改进。历史上，基于金属离子亲和作用的 His-tagged 蛋白纯化（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）广泛应用于实验室与工业场景。然而，现有的 IMAC 技术在纯化一些表达浓度低或原生状态蛋白方面效率不高，其性能受限于基质微孔堵塞、金属离子密度低以及比表面积有限等问题。此外，现有替代方案如磁性纳米颗粒和钴基亲和树脂价格高昂，操作时间较长，实用性受限。本研究旨在提出一个高效的新型方案，用于改进蛋白纯化过程。

研究目标包括设计一种能够增强蛋白质渗透能力、提高金属离子密度，并减少合成过程微孔堵塞问题的新型材料。具体设计为一种基于 Nitrilotriacetic Acid (NTA) 的微凝胶，该材料通过一种简化的合成路径制备。

研究流程与方法

研究工作分为以下几个步骤：

1. 合成 NTA 单体与制备微凝胶颗粒

研究利用 N,N-bis(carboxymethyl)-L-lysine 和 acryloylchloride 在碱性条件下反应，合成 NTA 单体。经旋转蒸发去除溶剂、离子交换去除钠离子，然后通过冷冻干燥获得高纯度的油状 NTA 单体。合成的 NTA 单体化学结构通过 1H-NMR 核磁共振表征证实。

在微凝胶颗粒的制备过程中，NTA 单体被溶解在 Tris/HCl 缓冲液中，并与丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酸混合后，生成含 NTA 功能单元的乳液体系。乳液经探针超声并在氮气保护下进行聚合反应，通过 TEMED 和过硫酸铵实现氧化还原聚合。反应后的颗粒被以甲醇沉淀，收集颗粒后将其溶浸于 NiSO₄ 溶液中进行金属离子负载处理。最终得到带有 Ni²⁺ 的微凝胶颗粒，其直径均一，平均粒径为 6.5±0.8 μm。

2. 微凝胶蛋白结合性能的测试

为验证微凝胶颗粒对 His-tagged 蛋白质的结合与回收能力，研究使用了 His-tagged 绿色荧光蛋白（GFP, 29 kDa）及未标记的 GFP（26.8 kDa）作为模型蛋白。实验步骤包括： - 将微凝胶与 His-tagged GFP 溶液（0.2 mg 微凝胶，20 μg/600 μL GFP 溶液）孵育 20 分钟，离心分离颗粒与未结合的 GFP 溶液后，通过荧光发射强度检测其结合效率。 - 用 300 mM 的咪唑（imidazole）溶液处理被 His-tagged GFP 负载的微凝胶颗粒，以释放结合的蛋白。从荧光数据计算回收效率，平均值约为 65%。

此外，重复利用实验显示，微凝胶在多次使用后的蛋白回收效率分别为 79% 和 77%，表明重复使用可能导致蛋白的累积，但整体效率影响不大。

3. 微凝胶的结构与镍离子分布分析

使用双束（聚焦离子束与电子束结合）的扫描电镜（SEM）与能量色散 X 射线分析（EDX），研究了颗粒的内部结构与镍离子分布。颗粒表面与内部均匀分布着大约 20%（w/w）的镍离子浓度。荧光共聚焦显微镜的实验结果显示，His-tagged GFP 可渗透至颗粒径的一半深度（约占总体积的 82.5%）。

4. 与商用微粒比较的蛋白结合性能评估

研究将 0.5 mg 自制微凝胶与市场上商品化的 Ni-NTA 琼脂糖粒子（58 ± 15.6 μm）对比，结果显示前者的蛋白结合能力高出 3.7 倍。考虑到颗粒尺寸对比表面积的影响，不同粒径（6.5 μm 和 51.1 μm）的自制微凝胶被进一步测试。结果显示，即使粒径一致，自制微凝胶的结合能力仍高出商品化颗粒 3 倍。

通过 BET 氮吸附法，该研究还表明微凝胶的比表面积是商品化颗粒的三倍以上（12.95 m²/g 比 3.52 m²/g），孔径体积也更大。

研究结果与结论

1. 主要发现：

   • 微凝胶颗粒在 His-tagged 蛋白质结合和回收中表现出高效性能。其优越性能与较高的镍离子浓度（>20% w/w）、大的比表面积以及内部孔结构的可访问性有关。
   • 操作简便、低成本合成路径的微凝胶制备方法适合大规模生产。
   • 浓度和粒径优化可显著提升蛋白质分离效率。

2. 科学意义与应用价值：

   • 研究成果提供了一种高效可再生的 IMAC 材料，可以广泛用于实验室生物医药研究和工业化生产蛋白纯化。
   • 微凝胶材料的设计理念也可能用于其他生物分子分离技术、水净化技术和表面涂层等领域。

3. 研究亮点：

   • NTA 功能单体的均匀分布减少了合成过程中基质微孔堵塞现象。
   • 微凝胶在同类产品中表现出极优越的结合能力和重复使用性能。

这项研究通过结合新材料设计和工艺简化，为 His-tagged 蛋白纯化开创了新的路径，具有广泛的学术与工业价值。