本研究发表于*Journal of Chromatography A*期刊2015年第1376卷。研究团队的主要作者为Feng Gu，通讯作者单位与所有其他作者（Kiran Chodavarapu, Dennis McCreary, Thomas A. Plitt, Edward Tamoria, Michelle Ni, Jennifer J. Burnham, Michael Peters）均来自美国马里兰州的W. R. Grace公司。此外，共同作者Abraham M. Lenhoff来自特拉华大学化学与生物分子工程系。该研究旨在开发一种基于硅胶的、用于一次性生物工艺过程的聚合物功能化离子交换材料。
该研究的学术背景位于生物分离科学与蛋白质纯化技术领域。离子交换材料广泛应用于蛋白质和其他生物制品的分离纯化。目前生物加工中最常用的层析介质是功能化的天然聚合物树脂（如琼脂糖）或合成聚合物，而硅胶尽管在小分子纯化（如反相高效液相色谱）中应用广泛，却较少用于大规模蛋白质纯化。这主要是因为工业上通常使用氢氧化钠溶液进行在位清洗（CIP），而硅胶在强碱条件下不稳定。然而，当前生物制药制造业正朝着一次性使用技术的趋势发展。在这种一次性、可抛弃的工艺中使用硅胶，可以完全消除CIP程序及后续的重新验证要求，彻底杜绝交叉污染的可能性，从而为工艺增加价值。特别是对于高细胞毒性的抗体药物偶联物（ADCs）的纯化，一次性使用层析可能尤为关键。与聚合物树脂相比，硅胶具有不可压缩的优点，允许高流速运行，同时具有成本低、粒径和孔结构选择广泛、表面修饰化学方法多样等优势。
本研究的主要目标是开发硅基的、聚合物功能化的离子交换材料，用于一次性生物工艺应用，最终目的是实现对目标蛋白质的最大化结合容量。研究探索了利用Grace®宽孔硅胶并通过键合阳离子聚合物来制备强阴离子交换（Q型）材料。研究旨在通过精细调整聚合物组成和匹配硅胶特性，以实现优异的性能。为此，研究团队深入考察了硅胶特性（尤其是最佳孔径和孔径分布对蛋白质结合的影响）以及化学过程（包括单体的选择、初始键合和后续聚合中试剂的用量和比例、聚合物接枝量以及聚合反应条件）的优化。
该研究详细的工作流程主要分为材料制备、表征、性能测试与比较几个核心部分。
第一，Q-硅胶材料的制备工艺。 研究采用了一种两步法反应过程来制备强阴离子交换材料（称为Q-硅胶）。如图1所示，第一步是“初始键合”：将两种硅烷偶联剂——3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（乙烯基硅烷）和3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（环氧硅烷）——的混合物滴加到经烘箱干燥的硅胶中，在室温下于旋转蒸发仪上缓慢滚动过夜。随后，用0.5 M硫酸酸化以打开环氧环，再经去离子水多次洗涤。此步骤旨在硅胶表面引入可聚合的乙烯基官能团和亲水的二醇（由环氧基水解得到）官能团，后者用于改善表面润湿性，以便后续在水相中进行聚合。第二步是“水溶液自由基聚合”：将第一步得到的改性硅胶与含有季铵盐的单体（主要是[3-丙烯酰氨基丙基]三甲基氯化铵，以及少量的二烯丙基二甲基氯化铵作为共聚单体）以及偶氮引发剂V50一同置于反应瓶中。体系经氮气鼓泡除氧后，逐步加热至60°C并保持2小时进行聚合反应。反应后，混合物用氯化钠溶液稀释、过滤，并先后用NaCl溶液和去离子水洗涤多次，直至样品中不含游离的未接枝聚合物，最终得到Q-硅胶材料。
第二，材料与聚合物的表征。 研究采用了多种物理和化学方法对材料和中间产物进行表征。硅胶基体的中值粒径通过激光散射测定。孔径分布通过汞孔隙度法测定，并定义了中值孔径和跨度等参数。比表面积通过氮气吸附法测定。化学组成方面，使用碳分析仪测定改性硅胶样品的碳含量，以监控硅烷键合量和聚合物接枝量（净碳增量）。为了验证关于聚合物链长影响的假设，研究团队开发了一种独特的分析方法来测定表面接枝聚合物的分子量：用氢氟酸处理Q-硅胶样品，将聚合物链从硅胶表面切断，然后通过凝胶渗透色谱法分析上清液中的聚合物，以聚乙二醇和聚环氧乙烷为标准品测定其分子量及分布。此外，还使用电子微探针结合电感耦合等离子体原子发射光谱法分析了功能基团在颗粒内部的分布情况，方法是将树脂的Cl-反离子交换为磷酸根离子，然后通过微探针扫描磷元素分布，或通过ICP-AES测定总磷含量。
第三，蛋白质结合性能测试。 以牛血清白蛋白作为模型蛋白质，评估新材料的性能。静态结合容量测试是将干燥的Q-硅胶样品与BSA溶液在特定缓冲液中孵育过夜，经过洗涤后，用高盐缓冲液洗脱结合的蛋白质，通过紫外-可见分光光度法测定洗脱液在280 nm处的吸光度来计算结合量。动态结合容量测试则是将样品装填到玻璃层析柱中，使用ÄKTA® explorer系统，让一定浓度的BSA溶液以特定线速度流过柱子，通过监测流出液的UV信号绘制穿透曲线，并按5%穿透点计算DBC。研究还测试了不同线性流速下的DBC和柱背压。此外，为了评估分离性能，研究测试了三种模型蛋白质混合物（BSA、伴清蛋白和淀粉葡萄糖苷酶）在Q-硅胶柱上的梯度洗脱分离效果，并与商品化的琼脂糖基强阴离子交换介质（GE Capto® Q）进行了对比。
第四，工艺优化与比较研究。 研究系统地优化了制备工艺。考察了初始键合中硅烷用量与键合效率（碳含量）的关系，发现低硅烷用量时键合产率接近70%，但随着用量增加产率下降，最大表面覆盖度与文献报道的硅醇羟基可键合比例一致。考察了聚合物接枝量（净碳增量）与BSA结合容量的关系，发现更高的接枝量通常对应更高的结合容量。特别重要的是，研究发现了“碳百分比比率”（净碳增量与初始键合碳含量的比值）对性能的关键影响：在相同的聚合物接枝量下，较低的初始键合碳含量（即较低的表面可聚合点密度）和较高的碳百分比比率，意味着生成的聚合物链更长，这导致了更高的静态和动态结合容量（可提高20%以上）。这一假设通过直接测定两个对比样品的接枝聚合物分子量得到了证实：碳百分比比率高的样品，其聚合物分子量（163.5 kDa）显著高于比率低的样品（116.5 kDa）。研究还优化了共聚单体和引发剂的用量，发现减少引发剂用量（从而可能增长链长）能显著提升结合容量。研究比较了不同单体结构，发现具有酰胺连接臂的单体比具有酯连接臂的单体表现更好，接枝量更高，结合容量也更高。
第五，硅胶基体特性的影响研究。 研究系统比较了不同中值孔径（从250 Å到3000 Å）的Grace®宽孔硅胶在相同工艺下制成的Q-硅胶性能。结果表明，对于BSA的结合，最佳的孔径范围在500-1250 Å之间，其中约800 Å时结合容量最高。研究还发现，接枝聚合物的分子量有随硅胶孔径增大而增加的趋势。此外，研究将Grace® 1000 Å硅胶与其他商业品牌的硅胶或可控孔玻璃（CPG）在相同优化工艺下进行了比较。Grace®硅胶具有更宽的孔径分布（跨度值大）、较大的孔体积和比表面积。这些结构差异导致了最终产品性能的显著不同：以Grace®硅胶为基体的Q-硅胶表现出比其他硅胶基产品高得多的BSA结合容量（动态结合容量达151 mg/mL），而其他品牌硅胶基产品的DBC均在108 mg/mL以下。研究将这种优势归因于Grace®硅胶的宽孔径分布和大孔体积为蛋白质分子提供了更易通达的孔隙和更大的可利用体积。
第六，与商品化琼脂糖基材料的性能对比。 这是研究的亮点之一。研究将优化的Q-硅胶（文中亦称Grace® Provance™ Q）与广泛使用的琼脂糖基强阴离子交换介质Capto® Q进行了头对头比较。结果显示：1. 动态结合容量与流速关系：在低流速下，两者的DBC相当。但随着线性流速升高（最高至1500 cm/h），Q-硅胶的DBC下降幅度更小，而Capto® Q的DBC下降更为明显。2. 柱压特性：由于硅胶的不可压缩性，Q-硅胶柱在高达1200 cm/h流速下的背压，仅相当于Capto® Q柱在700 cm/h（其推荐上限附近）的背压。这赋予了Q-硅胶在高流速下运行的能力，可缩短纯化时间。3. 蛋白质洗脱特性：使用1 M NaCl进行阶梯洗脱时，BSA从Q-硅胶柱上洗脱更快、更集中，而从Capto® Q柱上洗脱则表现出明显的拖尾现象。4. 分离分辨率：在分离三种蛋白质混合物时，Q-硅胶柱能产生更尖锐的洗脱峰，并实现了近乎基线的分离，表现出比Capto® Q更好的分辨率。微探针和ICP分析表明，两种树脂的功能基团总量（单位柱体积）是相近的，Q-硅胶的性能优势主要归因于其刚性的硅胶基质和优化的聚合物“触手”结构所带来的更优传质和可及性。
本研究的主要结论是成功开发了一种高性能的硅基强阴离子交换材料制备方法。通过采用简单的两步法水相工艺，避免了传统方法中使用有毒试剂（如铈盐、氯化亚砜）或昂贵催化剂的问题。研究明确了实现高蛋白质结合容量的关键因素：在材料设计上，需要选择具有宽孔径分布（跨度>1.0）、最佳中值孔径（500-1500 Å）和大孔体积的硅胶作为基体；在化学工艺上，需要控制形成较低表面引发点密度和较高分子量的接枝聚合物链（即高“碳百分比比率”）。最终获得的Q-硅胶材料，在蛋白质动态结合容量、洗脱效率和分离分辨率方面均优于或相当于商品化的琼脂糖基强阴离子交换材料，并且因其不可压缩性而具备卓越的流动特性和高流速运行潜力。
该研究的科学价值在于，它系统性地揭示了硅胶基“触手型”离子交换介质结构与性能之间的关系，特别是硅胶孔径分布、聚合物接枝密度与链长对蛋白质吸附行为的协同影响机制，为理性设计高性能层析介质提供了重要见解。其应用价值尤为突出：所开发的Q-硅胶材料非常适合用于新兴的“一次性使用”生物工艺，能够免除苛刻的清洗验证，尤其适用于高价值、高毒性产品（如ADCs）的纯化，同时其高流速潜力有助于提高生产效率、缩短工艺时间。研究证明了硅胶在蛋白质大规模纯化中的应用可行性，挑战了传统上认为硅胶不适用于生物加工的认知。
本研究的亮点在于：1. 重要的发现：明确了“低引发点密度+高聚合物链长”是提升“触手型”介质蛋白质结合容量的有效策略，并通过实验直接测定了表面接枝聚合物的分子量予以证实。2. 方法的创新性：开发了一种简便、环保（几乎无需有机溶剂）且易于放大的水相聚合接枝工艺。建立了通过HF处理结合GPC来测定键合在无机载体表面聚合物分子量的分析方法。3. 研究对象的特殊性：聚焦于一次性生物工艺这一工业新趋势，针对性地开发硅胶基介质，解决了该场景下的关键技术需求。4. 全面的比较研究：不仅优化了内部工艺，还系统比较了不同硅胶基体的影响，并与当前市场主流产品进行了详尽的性能对比，数据充分，说服力强。研究最终成功地将基础材料科学、聚合物化学与生物分离工程需求相结合，产出了一项具有显著工业应用前景的技术成果。