中国科学家开发新型植物基因定向进化工具STEME系统
作者及机构
本研究由中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队主导，主要作者包括Chao Li、Rui Zhang、Xiangbing Meng等，合作单位包括中国科学院植物细胞与染色体工程国家重点实验室、中国科学院大学现代农业科学学院等。论文于2020年7月发表于*Nature Biotechnology*，标题为《Targeted, random mutagenesis of plant genes with dual cytosine and adenine base editors》。
学术背景
研究领域与动机
植物基因的定向进化（directed evolution）是作物性状改良的重要手段，但传统方法（如化学诱变、易错PCR）存在效率低、靶向性差等问题。CRISPR-Cas9系统虽能实现基因编辑，但其主要产生插入/缺失突变（indels），难以高效生成功能增益型点突变（gain-of-function mutations）。本研究旨在开发一种新型双碱基编辑器（dual base editor），通过同时靶向胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）的定向突变，实现植物基因的饱和诱变（saturation mutagenesis），加速作物性状改良。
科学问题
如何在不依赖外源基因转移或体外重组的情况下，直接在植物基因组中高效引入多样化点突变，以模拟自然进化过程并筛选有益性状？
研究流程
1. STEME系统的设计与构建
研究团队开发了五种饱和靶向内源诱变编辑器（STEME），其中STEME-1为核心工具。其结构包含：
- 脱氨酶融合蛋白：胞嘧啶脱氨酶（APOBEC3A）与腺嘌呤脱氨酶（ecTADA7.10）融合；
- Cas9变体：切口酶nCas9（D10A）用于单链DNA切割；
- 尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）：防止尿嘧啶被修复，提高编辑效率。
通过密码子优化和植物启动子（玉米Ubiquitin-1）驱动，STEME系统可在水稻原生质体中实现C>T和A>G同步编辑。
2. 原生质体水平验证
- 靶基因选择：针对水稻乙酰辅酶A羧化酶（OsACC）等基因设计sgRNA，覆盖56个氨基酸的编码区。
- 编辑效率分析：STEME-1的C>T编辑效率最高达61.61%，A>G效率达15.10%，且双碱基同步编辑效率为15.10%。STEME-NG（基于Cas9-NG变体）进一步扩展了PAM兼容性（如NGD序列）。
- 突变多样性：使用20个sgRNA对OsACC靶区进行饱和诱变，覆盖73.21%的氨基酸位点，产生41种氨基酸变异。
3. 植物水平应用与抗除草剂筛选
- 大规模转化：设计200个sgRNA靶向OsACC的400个氨基酸区域，分为27组进行农杆菌介导的水稻转化。
- 突变分析：在再生植株中检测到377个核苷酸变异，其中209个氨基酸位点发生改变（52.25%），包括错义突变（missense）、无义突变（nonsense）和同义突变（silent）。
- 抗性筛选：喷洒除草剂Haloxyfop后，筛选到携带P1927F、W2125C等突变的抗性植株。其中W2125C突变通过C>G颠换（transversion）产生，为已知抗性位点；P1927F为新发现突变，通过结构模拟证实其改变OsACC蛋白构象从而抑制除草剂结合。
4. 创新实验方法
- 并发选择策略：在愈伤组织阶段施加除草剂压力，富集抗性突变（如P1927F突变体占比从0.1%提升至100%）。
- 脱靶评估：全基因组扫描显示STEME系统脱靶率极低（仅1个非目标位点检测到突变）。
主要结果
1. 高效双碱基编辑：STEME-1在原生质体中C>T和A>G编辑效率显著高于传统碱基编辑器（如A3A-PBE和PABE-7），且indel频率低于0.63%。
2. 饱和诱变能力：STEME-NG对OsACC靶区实现73.21%的氨基酸覆盖度，远超单碱基编辑器的多样性。
3. 抗性性状创制：通过定向进化获得OsACC的四种抗除草剂突变（P1927F、W2125C、S1866F、A1884P），其中P1927F为首次报道。
结论与价值
科学意义
- 首次在植物中实现双碱基同步编辑，突破了传统CRISPR仅能产生indels的限制。
- 提出“原位定向进化”（in situ directed evolution）概念，无需外源基因即可直接在基因组中模拟自然变异。
应用前景
- 作物育种：快速创制抗除草剂、抗逆等性状；
- 基础研究：用于蛋白质功能域的高通量饱和突变分析；
- 技术扩展性：STEME系统可适配其他Cas变体，适用于任何CRISPR兼容的植物或生物体。
研究亮点
1. 多维度突变：STEME同时引入C>T、A>G、C>G、C>A等多种变异，大幅提升突变多样性。
2. 高精度与低脱靶：编辑窗口明确（C1-C17、A4-A8），且脱靶率低于0.05%。
3. 从实验室到田间：通过抗除草剂表型验证了STEME在作物改良中的直接应用价值。
其他发现
- STEME在植物中意外产生C>G颠换（占编辑产物的13.73%），为蛋白进化提供了额外变异来源。
- 结构生物学分析揭示了OsACC突变抗除草剂的分子机制（如W2125C破坏π-π堆叠相互作用）。
（注：全文基于Li et al., Nature Biotechnology 2020，数据均引自原文及补充材料）