本研究由新加坡国立大学药学系的Adeline Cheong、Joanne J. A. Low、Andrea Lim、Paul M. Yen以及Esther C. Y. Woon等人完成，发表于*Chemical Science*期刊2018年第9卷第36期，文章页码为7174–7185，于2018年8月7日在线发表。该研究属于化学生物学与表观遗传学交叉领域，主要聚焦于N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）去甲基化酶FTO（fat mass and obesity-associated protein）活性检测方法的开发与应用。
m6A是信使RNA（mRNA）上最丰富的表观遗传修饰之一，其甲基化水平由甲基转移酶（如METTL3-METTL14-WTAP复合物）和去甲基化酶（如FTO和ALKBH5）动态调控。FTO与肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎及阿尔茨海默病等多种人类疾病密切相关，但现有检测方法存在灵敏度低、通量低、无法用于活细胞实时分析等缺陷。为此，作者开发了首个荧光m6A开关型探针，能够高灵敏、高选择性地在体外和活细胞内直接检测FTO去甲基化酶活性。
该研究的工作流程可大致分为探针设计、体外验证、选择性评价、抑制剂筛选及活细胞应用五个阶段。在第一阶段，作者设计并合成了一系列长度不同的2‘-O-甲基RNA寡核苷酸探针，每条序列含有一个m6A修饰。这些探针以回文序列5’-GCGCGAGCUCGCGC-3‘为模板，中间为“AGCU”片段，两侧为“CG”片段。由于序列自互补性，它们可以在溶液中形成发夹或双链两种构象。作者假设，在特定序列背景下，m6A修饰会破坏双链碱基配对，使探针优先形成发夹结构；而去甲基化则恢复双链形成能力。通过紫外熔解曲线、圆二色光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，作者从12条候选序列中筛选出探针8、11和12，它们在甲基化状态下主要形成发夹结构，去甲基化后转变为A型双链结构。构象转变主要由焓驱动，例如探针12a向12b转变的焓变为−56.9 kcal mol⁻¹，而熵惩罚为−145.1 cal mol⁻¹ K⁻¹。随后，作者将荧光报告基团2’-O-(1-芘甲基)尿苷（U_p）引入探针的U7和U9位置，得到探针18a作为代表性m6A探针。U_p在发夹或单链环境中因光诱导电荷转移而荧光猝灭，但在紧凑的A型双链环境中因芘基团嵌入非猝灭性小沟而发出强荧光。18a在去甲基化后荧光量子产率由0.04升至0.24，荧光增强约12倍，并出现约475 nm的宽激基复合物发射峰。
在体外验证阶段，作者将10 μM m6A探针与0.5 μM FTO在含Fe(II)、2-氧戊二酸和L-抗坏血酸的HEPES缓冲液中37 °C孵育。荧光动力学显示30分钟内即可检测到明显信号增强，约2小时达到平台，荧光强度增加约10倍。高效液相色谱分析证实荧光增强与去甲基化产物生成呈线性正相关。对照实验表明，FTO R316Q突变体（活性降低80%）仅产生微弱荧光响应，而缺乏FTO、Fe(II)或2-氧戊二酸的体系均无荧光增强。动力学分析显示m6A探针的k_cat/K_m为1.05 min⁻¹ μM⁻¹，与含GG(m6A)CU共识基序的单链RNA或单链DNA底物效率相当，说明FTO可以高效去甲基化2’-O-甲基RNA上的m6A。此外，对照探针19a（将A6替换为C，破坏回文性，不能发生发夹-双链转变）虽能被FTO去甲基化，但不产生荧光增强，证明荧光开启严格依赖于构象转变。
在选择性评价阶段，作者测试了ALKBH2、ALKBH3和ALKBH5等同源酶。HPLC和荧光分析均显示这些酶不能有效去甲基化m6A探针，而ALKBH5却能去甲基化相应的RNA等价物，表明选择性可能源于2’-O-甲基骨架。灵敏度测试显示，在10 μM探针条件下，FTO浓度低至10 nM即可检测到活性，比传统方法灵敏至少100倍。作者还考察了探针在细胞裂解液中的稳定性，发现去甲基化产物在HEP G2细胞裂解液中至少24小时保持强荧光，表明其具有良好的抗核酸酶降解能力。
在抑制剂筛选阶段，作者使用384孔板评估了已知FTO抑制剂（24PDCA、LipoTF、Rhein、IOX3）和非抑制剂（异烟酸）的抑制效果。除异烟酸外，所有化合物均呈剂量依赖性荧光降低，测得的IC50与文献报道值一致。通过Zhang等人描述的方法计算Z’因子为0.68，表明该测定方法具有良好的统计可靠性，适用于高通量筛选。
在活细胞应用阶段，作者使用链球菌溶血素O可逆通透法将10 μM探针递送至HEP G2细胞。荧光显微镜显示1小时后细胞内出现明亮蓝色荧光，较对照探针增强约7倍，且信号主要定位于细胞质。流式细胞术分析显示，用不同浓度乙酯LipoTF预处理细胞可导致荧光信号剂量依赖性降低。FTO过表达显著增强探针荧光，而FTO siRNA敲低则降低荧光；ALKBH5过表达或敲低对荧光无显著影响，进一步证实探针在细胞内对FTO具有高度选择性。此外，作者将探针应用于3T3-L1前脂肪细胞分化过程的时间进程监测。在诱导分化第0、3、6、9天分别处理细胞，结果显示荧光强度随时间逐渐下降，第9天时较第0天降低约5.4倍，同时mRNA中m6A水平经斑点印迹分析证实相应增加，表明探针荧光可直接反映细胞内FTO活性的动态变化。
本研究的核心结论是：成功开发了首个荧光m6A开关型寡核苷酸探针，能够在体外和活细胞内直接、高灵敏、高选择性地检测FTO去甲基化酶活性。该探针利用m6A修饰对DNA/RNA双链稳定性的破坏效应，通过构象转变驱动U_p荧光开启，将单个甲基的去除放大为约10倍的荧光增强。该方法无需放射性底物、操作简便、蛋白消耗量低（纳摩尔级），且适用于高通量抑制剂筛选和单细胞流式分析。此外，该策略具有高度通用性，作者进一步证明含N1-甲基腺苷（m1A）、N1-甲基鸟苷（m1G）和N3-甲基胞嘧啶（m3dC）的类似探针也可在去除修饰后发生发夹-双链转变并伴随荧光增强，提示该设计可拓展至其他核酸修饰酶的研究。需要指出的是，该方法需要外源递送探针，递送效率可能因细胞类型而异，且不适用于对双链稳定性影响较小的修饰如5-甲基胞嘧啶（m5C）和N7-甲基鸟苷（m7G）。尽管如此，该研究首次实现了活细胞内FTO活性的直接监测，并首次实现了对FTO而非ALKBH5的细胞水平选择性检测，为阐明FTO在m6A介导的表观遗传调控中的作用及其与人类疾病的机制联系提供了有力工具。