血管生物学领域研究论文报告

一、研究作者、机构与发表信息

本研究由Prisca K. Lin、Zheying Sun和George E. Davis完成，作者均来自南佛罗里达大学莫尔萨尼医学院分子药理学与生理学系（Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Morsani College of Medicine, University of South Florida School of Medicine）。通讯作者为George E. Davis。该研究发表于*The American Journal of Pathology*第194卷第4期，2024年4月出版，论文于2023年8月15日被接收。研究受NIH基金HL136139、HL126518和HL149748及美国心脏协会博士前奖学金资助。

二、研究背景与研究目的

血管内皮细胞（endothelial cells）构成血管内壁衬里，是流体、营养和氧气交换的关键管道。在功能上，内皮细胞可分为两种主要的前形态发生细胞类型：内皮尖端细胞（EC tip cells）和内皮管腔形成细胞（EC lumen-forming cells），二者协同完成血管形态发生。尖端细胞位于生长血管的前沿，具有高度运动性和侵袭性；其后的管腔形成细胞则组装形成三维管腔空间。尽管对内皮管腔形成的分子和信号基础已有较多认识，但对血管出芽行为的信号转导级联及其影响仍缺乏清晰理解。

既往研究建立了“factor system”体外定义的无血清三维细胞外基质模型，通过五种生长因子——干细胞因子（stem cell factor, SCF）、白介素-3（IL-3）、基质细胞衍生因子-1α（stromal-derived factor-1α, SDF-1α）、成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2, FGF-2）和胰岛素——共同刺激内皮尖端细胞和管腔细胞行为，驱动毛细血管管网形成。微管稳定剂如紫杉醇和埃博霉素B可选择性抑制出芽行为而不影响管腔形成；而抑制Src、Notch等管腔形成信号则加速出芽行为，表明出芽与管腔形成受分离甚至相反的机制调控。毛细血管组装的第三个关键步骤是周细胞（pericyte）的招募：周细胞与内皮细胞共同沉积基底膜基质，促进管腔成熟与稳定。内皮细胞来源的五种周细胞招募因子包括血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）-BB、PDGF-DD、内皮素-1（endothelin-1, ET-1）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）和肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor, HB-EGF）。

超过20种不同突变已被描述于多种血管异常中，且许多突变具有致癌活性。例如，PI3K-Akt-mTOR通路与脑海绵状血管畸形（cerebral cavernous malformations, CCMs）的扩张性囊性病变相关；静脉畸形表达活化的Tie2受体酪氨酸激酶；内皮细胞表达活性KRASG12V与动静脉畸形相关。这些异常代表了导致中间毛细血管组装缺陷的关键致病特征，从而易诱发动静脉畸形。由于这些突变与疾病机制的明确关联，将特定基因突变与内皮细胞形态发生的血管生物学基础相连接至关重要。因此，本研究旨在利用体外三维定义平台系统性地探究特定分子、基因突变或信号通路如何影响血管形态发生和毛细血管组装的关键步骤。

三、研究流程与实验方法

本研究采用多策略实验方法，主要包括以下几个核心流程：

1. 活性突变内皮细胞系的建立。 研究人员使用慢病毒载体系统生成稳定表达活性突变基因的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）系。共建立了七个活性突变细胞系：活性KRAS（G12V）、活性MEK1（S218D/S222D）、活性PIK3CA（myr-Flag标记）、活性AKT1（myr-Flag标记）、活性RHEB（Q64L）、活性JAK2（V617F）和活性STAT3（A662C/N664C/V667L）。慢病毒载体的人类磷酸甘油酸激酶启动子诱导适度基因表达水平。感染后使用嘌呤霉素筛选10至14天获得稳定细胞系。通过RT-PCR验证各活性突变基因的表达升高。

2. 三维胶原蛋白基质生物测定平台。 采用四种类型的形态发生生物测定模型：（a）血管生成测定（vasculogenic assay）：将内皮细胞以单细胞形式悬浮于2.5 mg/mL的I型胶原蛋白基质中，在无血清定义的培养基中培养；（b）出芽测定（sprouting assay）：内皮细胞以单层形式接种于聚合凝胶表面，评估向下出芽的尖端细胞；（c）聚集体测定（aggregate assay）：内皮细胞聚集后在凝胶中悬浮培养；（d）内皮-周细胞共培养测定：内皮细胞与绿色荧光蛋白标记的周细胞以1:5比例共培养于胶原基质中。所有培养均在含五种生长因子的无血清定义培养基中于37°C、5% CO₂条件下进行。培养物在特定时间点用3%戊二醛固定并以0.1%甲苯胺蓝染色用于非荧光显像，或用3%多聚甲醛固定用于免疫荧光成像。使用Olympus CKX41显微镜采集甲苯胺蓝图像，Leica SP8共聚焦扫描显微镜采集免疫荧光图像，MetaMorph软件和Fiji/ImageJ进行图像定量分析。

3. 实时视频分析。 对照及各活性突变内皮细胞系在血管生成测定中组装72小时，每10分钟捕获单个视野，加工成实时视频。视频用于定量分析各细胞系随时间变化的管腔面积。

4. 管腔形成专项测定。 使用微管稳定剂埃博霉素B（10 nmol/L）选择性阻断出芽行为而不影响管腔形成，从而单独评估各内皮细胞系的管腔形成能力，包括囊性管腔形成。

5. 药理学抑制剂筛选。 多种抑制剂用于功能性实验：Ruxolitinib（JAK抑制剂）、SD1008（JAK抑制剂）、PD98059和U0126（MEK抑制剂）、PLX8394（B-Raf/C-Raf抑制剂）、Pictilisib（PI3K抑制剂）、MK2206（Akt抑制剂）、Rapamycin和Everolimus（mTOR抑制剂）、PP2（Src家族激酶抑制剂）、FRAX486和FRAX597（PAK抑制剂）、Gö6983（PKCε抑制剂）。所有药物浓度均经过优化剂量测试。

6. siRNA抑制实验。 使用Silencer Select siRNA对目标基因进行敲低，包括JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、PTEN和PP2A等。部分敲低效果通过Western blot分析确认。

7. Western blot分析。 从胶原蛋白凝胶培养中制备裂解物，在指定时间点（0、6、12、24、48、72小时）收集。使用一抗（1:1000稀释）孵育过夜后以HRP偶联二抗检测，X射线胶片采集结果。部分样品使用BioRad Gel Doc Imager XR采集并用ImageJ进行蛋白定量分析。

8. 基因表达分析。 使用Direct-zol RNA Miniprep Kit提取总RNA，反转录后使用TaqMan实时PCR测定法在QuantStudio 3实时PCR系统上定量转录表达水平。相对基因表达以GAPDH为内参，使用ΔΔCT方法计算。

9. 周细胞招募与基底膜沉积评估。 内皮-周细胞共培养120小时后固定，免疫染色CD31标记内皮细胞、I型胶原蛋白标记血管引导隧道（vascular guidance tunnels）、以及基底膜基质蛋白包括层粘连蛋白（laminin）、IV型胶原蛋白（collagen type IV）、纤连蛋白（fibronectin）、基底膜蛋白多糖（perlecan）、巢蛋白1和2（nidogen 1 and 2）。通过共聚焦显微镜成像评估周细胞与管道的关联百分比及基底膜沉积程度。

四、主要研究结果

活性KRAS、MEK1和AKT1促进管腔和管道形成。 血管生成测定分析显示，活性KRAS-、MEK1-和AKT1-表达的内皮细胞系形成显著升高的管腔面积，而活性JAK2、RHEB和STAT3的管腔形成能力与对照相似，活性PIK3CA表达的内皮细胞则显示显著降低的管腔面积。管腔宽度分析显示活性KRAS和AKT1内皮细胞的管腔宽度几乎为对照的两倍，而活性STAT3或PIK3CA的管腔则较对照更窄。活性KRAS和AKT1的过度管腔形成能力导致管道分支网络显著少于对照。实时视频分析证实了这些结论。共聚焦免疫染色显示对照内皮细胞产生狭窄、伸长且有分支的胶原基质隧道空间，而活性AKT1或KRAS内皮细胞则产生更宽、较少伸长和较少分支的隧道空间。

活性KRAS、MEK1和AKT1促进囊性管腔形成。 在埃博霉素B存在下，活性KRAS、MEK1和AKT1内皮细胞系显示出增加的囊性管腔形成，其中活性MEK1系表现出最大的刺激效果。活性PIK3CA、RHEB、JAK2和STAT3内皮细胞则未显示显著变化。

管腔形成关键信号通路的鉴定。 Western blot分析显示活性KRAS和AKT1内皮细胞在管道形成过程中表现出增加且更持久的PKCε、Src、PAK2、B-Raf和C-Raf磷酸化——这些都是已知的内皮管腔形成调节因子。CUB结构域蛋白1（CDCP1）的总蛋白和磷酸化水平在活性KRAS和AKT1内皮细胞中均升高，CDCP1是Src家族激酶的已知激活因子。Rasip1（管腔形成正调节因子）的水平在两种细胞系中也均增加。活化的组蛋白H3磷酸化在所有情况下均强烈下调，表明形态学差异并非由内皮细胞增殖所致。

药理学抑制和siRNA实验对管腔形成信号的验证。 靶向Ras-MAPK通路的药物包括PLX8394、U0126和PD98059显著降低内皮管腔面积；靶向PI3K-Akt-mTOR通路的药物包括Pictilisib、MK-2206、Rapamycin和Everolimus也显著降低管腔面积。siRNA敲低PTEN和PP2A（PI3K-Akt信号的负调节磷酸酶）增加了管腔形成。在活性AKT1内皮细胞中，PP2、FRAX486、FRAX597、PLX8394、U0126、PD98059和Gö6983均阻断管腔形成；Everolimus和Rapamycin也显著降低管腔和管道形成。最有效的阻断剂为Gö6983（PKCε抑制剂）和mTOR抑制剂。

活性PIK3CA和AKT1导致囊性管腔结构出现。 囊性管腔结构仅在活性PIK3CA-或AKT1-表达的内皮细胞中可见。囊性管腔数量分析显示活性PIK3CA和AKT1较对照显著增加。实时视频证实了活性PIK3CA内皮细胞形成囊性管腔结构的能力。在活性AKT1内皮细胞中，Rapamycin、Everolimus和Gö6983显著阻断囊腔形成；而两种MEK抑制剂（U0126和PD98059）和PAK2抑制剂FRAX597则增加了囊腔形成。

出芽行为的调控。 活性JAK2、STAT3、PIK3CA、RHEB和MEK1表达显著促进出芽，而活性KRAS和AKT1表达则显著减少出芽，其中活性AKT1的抑制效果最强。PP2处理对照内皮细胞增强了出芽行为；在PP2存在下，过度出芽的细胞系不再显示增加的出芽行为，而活性KRAS和AKT1内皮细胞仍显示强减低的出芽行为。

JAK/STAT信号对出芽行为的关键作用。 Ruxolitinib添加至对照内皮细胞的血管生成测定中导致短而宽的管腔和钝端。Ruxolitinib和SD1008均强烈阻断聚集体测定中的出芽。siRNA抑制JAK1和JAK2均显著阻断出芽，其中JAK2是主导异构体；siRNA抑制STAT3和STAT5A也阻断出芽。药理学抑制剂对活性JAK2和STAT3内皮细胞的测试显示Ruxolitinib、SD1008、U0126和PD98059显著降低两者的出芽行为。

活性突变导致毛细血管组装缺陷。 活性KRAS-、MEK1-和AKT1-表达的内皮细胞在共培养中形成异常宽的管道网络，周细胞的存在并未拯救这一表型。周细胞定量分析显示约一半的周细胞未与活性KRAS、AKT1和PIK3CA内皮细胞管道关联，其中活性AKT1的内皮细胞表现出最严重的招募缺陷。qPCR分析显示活性AKT1内皮细胞的PDGFB、PDGFD、EDN1和TGFB1 mRNA表达大幅降低；活性PIK3CA内皮细胞显示PDGFB、PDGFD和TGFB1降低；活性KRAS内皮细胞显示PDGFD和TGFB1降低。活性MEK1、RHEB、JAK2和STAT3内皮细胞均显示PDGFB和PDGFD表达降低。

基底膜基质沉积减少。 对照内皮细胞管网络显著组装了所有六种基底膜组分。活性KRAS、PIK3CA和AKT1内皮细胞——周细胞招募最差的三种类型——也显示出基底膜沉积的最大减少。活性KRAS内皮细胞管道显示层粘连蛋白、IV型胶原蛋白和基底膜蛋白多糖的强减少；活性PIK3CA内皮细胞显示IV型胶原蛋白、纤连蛋白和基底膜蛋白多糖的强减少；活性AKT1内皮细胞显示IV型胶原蛋白、纤连蛋白、基底膜蛋白多糖、巢蛋白1和2的减少。活性MEK1和活性RHEB内皮细胞管道显示IV型胶原蛋白和基底膜蛋白多糖的减少；活性STAT3内皮细胞管道显示层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、基底膜蛋白多糖和巢蛋白1的沉积减少。

五、结论与研究价值

本研究通过系统性分析鉴定了控制毛细血管形态发生和成熟的基本信号机制。核心结论包括：活性KRAS、MEK1和AKT1信号是主要的内皮管腔驱动因子，增强管腔面积、管腔宽度和血管引导隧道形成；活性PIK3CA和AKT1刺激特殊类型的囊性管腔形成；而内皮出芽行为的关键驱动因子是JAK2、STAT3、MEK1、PIK3CA和mTOR。活性AKT1、KRAS和PIK3CA的内皮表达导致显著失调的管腔形成，同时强烈抑制周细胞招募和基底膜沉积。其中活性AKT1表达过度刺激管腔形成、减少出芽行为，并显示最小的周细胞招募，同时PDGF-BB、PDGF-DD和ET-1的mRNA表达降低。

研究的科学价值在于：首次系统性地将七种致癌激活突变与内皮细胞形态发生的各个关键步骤直接关联，揭示了管腔形成与出芽行为之间的分离调控机制，以及这些突变如何导致毛细血管缺陷状态的机制细节。研究为理解血管畸形发生的分子基础提供了新见解。在应用价值方面，该研究展示的factor system衍生平台可作为强大的研究工具，将特定基因和信号与血管形态发生关联，并可指导治疗策略的开发和推进。药理学抑制剂实验鉴定的分子靶点——特别是PKCε、Src、PAK、Raf、MEK和mTOR——为血管疾病的治疗干预提供了潜在靶点。

六、研究亮点

本研究的突出亮点包括：（1）使用七种活性突变内皮细胞系进行系统性平行比较，这在既往研究中较为罕见；（2）开发了埃博霉素B选择性抑制出芽的专用管腔形成测定方法，实现了对管腔形成能力的单独评估；（3）利用PP2增强出芽的救援测定来识别具有内在出芽缺陷的细胞系；（4）通过实时视频分析动态观察72小时的形态发生过程；（5）将形态发生表型与分子信号和基因表达变化进行整合分析；（6）揭示了管腔形成与出芽行为在信号通路上呈现部分对立的关系——过度活跃的管腔形成往往伴随着出芽行为的强烈抑制。