靶向细胞质量控制的新型调控轴：TRIM5α通过泛素化TBK1驱动线粒体自噬机制的研究报告
由美国新墨西哥大学健康科学中心分子遗传学与微生物学系的Michael A. Mandell（通讯作者）、挪威北极大学Tromsø分校医学系自噬研究小组、以及Manipal高等教育学院的Bhaskar Saha等人共同主导的一项研究，于2024年6月25日发表在Cell Press旗下的期刊*Cell Reports*（卷43，文章号114294）。该研究揭示了在维持细胞健康至关重要的线粒体质量控制（线粒体自噬，mitophagy）过程中，两种已知的抗病毒蛋白——TRIM5α和TBK1（TANK-binding kinase 1）——如何协同工作，并阐明了蛋白质翻译后修饰（泛素化）在此过程中的核心调控作用。
学术背景与研究目标
线粒体是细胞的能量工厂，但其功能失调会产生活性氧等有害物质，并泄漏促炎性分子，与心血管疾病、代谢性疾病、神经退行性疾病及癌症等多种疾病密切相关。因此，细胞通过“线粒体自噬”这一选择性自噬过程，及时清除受损或多余的线粒体，对于维持细胞内稳态和机体健康至关重要。
线粒体自噬的启动依赖于一系列蛋白在受损线粒体表面的有序募集和激活。其中，激酶TBK1是一个关键调节因子，它在线粒体受损后能迅速被招募至线粒体，并通过磷酸化自噬接头蛋白（如optineurin, p62/SQSTM1, NDP52等），增强它们与泛素化蛋白及核心自噬机器（如ULK1/FIP200复合体）的结合能力，从而启动自噬体形成。然而，TBK1如何在受损线粒体上被精确激活，其机制尚未完全阐明。另一方面，TRIM家族蛋白（Tripartite motif family）因其抗病毒功能而被熟知，特别是TRIM5α能限制HIV-1等逆转录病毒的感染。有趣的是，全基因组关联研究也发现TRIM5α与代谢或心血管疾病相关，提示其可能具有维持细胞稳态的功能。此前，该研究团队已发现TRIM5α在线粒体自噬中扮演重要角色，但其具体作用机制未知。
基于以上背景，本研究旨在探究：1) TRIM5α是否以及如何参与调控TBK1在线粒体自噬中的作用；2) 这种调控是否涉及蛋白质泛素化这一关键修饰；3) TRIM5α和TBK1这两个抗病毒蛋白在细胞质量控制中的功能协同机制。最终目标是为线粒体自噬的分子调控网络提供新的见解，并揭示抗病毒蛋白在细胞稳态维持中的“兼职”功能。
详细研究流程与设计
本研究综合运用了分子细胞生物学、生物化学和高分辨率成像技术，主要包含以下几个递进的研究环节：
第一环节：验证TRIM5α与TBK1在损伤诱导的线粒体自噬中的相互作用及其必要性。 * 研究对象与样本量： 研究使用了多种人源细胞系，包括HEK293T、HeLa、Huh7细胞及其基因编辑衍生物（如TRIM5敲除、TBK1敲除、TRIM5/TBK1双敲除细胞）。每次实验通常包含至少三个独立的生物学重复（n ≥ 3）。 * 处理与实验： 1. 诱导线粒体损伤： 使用两种不同机制诱导线粒体自噬：① 线粒体解偶联剂CCCP（诱导Parkin依赖的途径）；② 抗寄生虫药物伊维菌素Ivermectin（诱导Parkin非依赖的途径）。 2. 免疫共沉淀（Co-IP）： 在基础状态和线粒体损伤处理后，分别用GFP抗体沉淀GFP-TRIM5α，检测其是否能与内源性或外源表达的TBK1（特别是其活化形式，即丝氨酸172位点磷酸化的pTBK1）发生相互作用。同时，也反向验证了内源性TRIM5α与TBK1的相互作用。时间进程实验（处理0.5-4小时）用于追踪相互作用动态变化。 3. 细胞成像： 使用共聚焦显微镜，观察HA-TRIM5α与内源性pTBK1在HeLa细胞中的共定位，特别是在mCherry-Parkin标记的受损线粒体附近的共定位。采用邻近连接技术（PLA）在单细胞水平精确验证TRIM5α与TBK1的相互作用发生在空间上极为接近的位置（<40 nm）。 4. 亚细胞分级分离： 分离野生型和TRIM5敲除细胞在处理后的线粒体组分，通过免疫印迹定量检测pTBK1在受损线粒体上的富集程度。 * 结果与逻辑推进： 结果显示，CCCP和伊维菌素处理均能显著增强TRIM5α与TBK1（包括活化的pTBK1）的相互作用，且这种相互作用在损伤后30分钟内即可增强。PLA和共聚焦成像证实这些复合物在受损线粒体表面形成。最重要的是，在TRIM5敲除细胞中，即使发生线粒体损伤，pTBK1也无法有效募集到线粒体上；而重新表达野生型TRIM5α则可挽救这一缺陷。这些结果确立了TRIM5α是TBK1在线粒体损伤后被募集并活化的必要条件，为后续研究两者功能联系奠定了基础。
第二环节：探究TBK1是否位于TRIM5α的下游，并介导其自噬功能。 * 研究对象与处理： 使用野生型和TRIM5敲除的Huh7细胞，经CCCP或伊维菌素处理。 * 实验： 1. 高内涵成像： 检测TBK1的底物之一——p62/SQSTM1在丝氨酸349位点的磷酸化（p-SQSTM1）水平，其斑点数量代表TBK1的激酶活性。在TRIM5敲除细胞中，损伤诱导的p-SQSTM1斑点形成显著减少。 2. 线粒体组分分析： 在TRIM5敲除和TRIM5/TBK1双敲除细胞中重新表达GFP-TRIM5α，分离线粒体组分，检测核心自噬蛋白（ULK1, p-ULK1, FIP200）以及TBK1磷酸化的接头蛋白（p-SQSTM1, p-Optineurin）的线粒体定位。同时，使用TBK1特异性抑制剂BX-795进行平行验证。 * 结果与逻辑推进： TRIM5缺失导致TBK1活性底物磷酸化受阻。更重要的是，在TRIM5/TBK1双敲细胞中，重新表达TRIM5α无法挽回自噬蛋白向线粒体的募集；使用TBK1抑制剂也得到了相同结果。这证明TRIM5α在线粒体自噬中的作用严格依赖于TBK1，TBK1是TRIM5α功能的下游执行者。
第三环节：核心机制探究——TRIM5α是否通过泛素化TBK1来调控其功能。 * 研究对象： HEK293T和Huh7细胞，包括野生型和TRIM5敲除型。 * 关键实验与技术： 1. 泛素化检测： 在表达GFP-TRIM5α和TBK1的细胞中，进行免疫共沉淀，使用泛素抗体检测TBK1的泛素化水平。为排除间接相互作用，进行了变性条件下的免疫沉淀。实验发现TRIM5α能显著促进TBK1的泛素化。 2. 损伤诱导的泛素化： 检测内源性TBK1在CCCP处理后的泛素化变化，发现其在野生型细胞中显著增强，而在TRIM5敲除细胞中增强幅度大幅减弱。时间进程实验显示，CCCP和伊维菌素均能以TRIM5α依赖的方式快速诱导TBK1泛素化。 3. 泛素链类型鉴定： 使用只能形成K63类型泛素链的泛素突变体（K63-only Ub）进行实验，证实线粒体损伤诱导的、TRIM5α依赖的TBK1泛素化主要是K63连接型。K63泛素链通常与信号转导和蛋白复合物组装相关，而非蛋白酶体降解。 4. 酶活性关键性验证： 使用TRIM5α的E3连接酶活性缺失突变体（E11R）。该突变体不能促进TBK1泛素化，也无法恢复pTBK1及ULK1/FIP200复合体在TRIM5敲除细胞中线粒体损伤后的定位。 5. 去泛素化验证： 构建了融合有活性或失活疱疹病毒去泛素化酶（DUB）的TRIM5α。融合活性DUB的TRIM5α（DUB-TRIM5α）显著降低了其促进TBK1泛素化的能力，并无法挽救TRIM5敲除细胞的线粒体自噬缺陷，而融合失活DUB的（DUB*-TRIM5α）则功能正常。这反向证明了泛素化修饰（很可能是TRIM5α催化产生的）对于其功能至关重要。 * 结果与逻辑推进： 本环节提供了确凿证据，证明TRIM5α作为一个E3泛素连接酶，在线粒体损伤时催化TBK1发生K63连接的多聚泛素化，且该修饰是TBK1在线粒体上激活并执行后续自噬招募功能的前提。
第四环节：确定TBK1泛素化位点及其功能意义。 * 研究对象： 构建了TBK1的赖氨酸（泛素化位点）突变体。基于文献，将K30和K401两个位点突变为精氨酸（R），构建了双位点突变体（2x K/R）。 * 实验： 1. 泛素化水平检测： 比较野生型TBK1和2x K/R突变体在基础状态和CCCP处理后的K63泛素化水平。2x K/R突变体的基础泛素化显著降低，且在损伤早期无法被有效泛素化，证实K30/K401是主要位点。 2. 功能挽救实验： 在TBK1敲除的Huh7细胞中，重新表达野生型TBK1或2x K/R突变体，利用线粒体-targeted Keima（Mito-Keima）荧光报告系统（通过流式细胞术检测溶酶体递送）或检测线粒体蛋白（如COX II）的降解来量化线粒体自噬效率。 3. 定位与下游招募分析： 通过线粒体分级分离和共聚焦显微镜定量分析，比较表达野生型或突变体TBK1的细胞中，pTBK1在线粒体上的富集情况，以及自噬接头蛋白（NDP52, NBR1等）和核心自噬蛋白（ULK1, FIP200）的募集。 4. 相互作用分析： 通过免疫共沉淀，检测野生型和2x K/R突变体TBK1与内源性自噬接头蛋白（NDP52, NBR1, SQSTM1）的结合能力。同时，敲低负责合成K63泛素链的关键E2酶UBC13，观察其对TBK1与接头蛋白相互作用的影响。 * 结果与逻辑推进： 2x K/R突变体虽然蛋白表达正常，但在恢复线粒体自噬能力、促进pTBK1在线粒体定位、以及招募下游自噬蛋白等方面均显著弱于野生型TBK1。生化实验进一步证明，K63泛素化增强了TBK1与多个自噬接头蛋白之间的相互作用，且UBC13的敲低会破坏这些相互作用。这表明TRIM5α介导的TBK1 K63泛素化，通过“招募”含有泛素结合结构域的自噬接头蛋白，促进了TBK1在受损线粒体表面的聚集和激活。
第五环节：阐明TRIM5α与TBK1相互作用的“桥梁”分子。 * 实验： 1. 检测TRIM5α自身的修饰与相互作用： 发现线粒体损伤同样能诱导TRIM5α发生K63连接的自体泛素化，并且其酶活性突变体（E11R）的泛素化程度降低。 2. 检测TRIM5α与自噬接头蛋白的相互作用： 损伤处理增强了TRIM5α与NDP52、NBR1、SQSTM1等接头蛋白的结合。UBC13敲低破坏了这些相互作用，表明其依赖K63泛素链。 3. 关键验证实验： 使用缺失全部五种主要自噬接头蛋白（NDP52, Optineurin, p62, NBR1, Tax1bp1）的“五敲”（pentako）细胞系。在这类细胞中，线粒体损伤无法再增强TRIM5α与TBK1的相互作用。同时，UBC13敲低或使用DUB-TRIM5α也减弱了二者的结合。 * 结果与逻辑推进： 此环节揭示了完整的作用链条：线粒体损伤 → TRIM5α活化并发生K63自泛素化 → K63泛素链吸引自噬接头蛋白 → 接头蛋白同时结合泛素化的TBK1（其泛素化也由TRIM5α催化）→ 从而间接地将TRIM5α与TBK1“桥接”在一起，形成一个以K63泛素链为支架的多蛋白复合物。这解释了为何在缺失接头蛋白或破坏K63链合成的条件下，TRIM5α与TBK1的损伤诱导性结合会受损。
第六环节：探索TRIM家族其他成员的可能作用。 * 实验： 研究发现，与TRIM5α高度同源的TRIM27也能在TRIM5敲除细胞中恢复线粒体自噬。两者在受损线粒体上共定位，且损伤能增强它们的相互作用。表达TRIM27还能促进TRIM5α与TBK1的结合。 * 结果与逻辑推进： 这表明TRIM家族成员在线粒体自噬调控中可能存在功能重叠或协同，扩展了TRIM蛋白在细胞质量控制中的作用范围。
主要研究结果总结
结论与研究价值
本研究得出核心结论：TRIM5α通过催化TBK1的K63泛素化，构建了一个以泛素链为支架、包含自噬接头蛋白的多分子组装平台。这个平台驱动了TBK1在受损线粒体上的激活，从而协同组装线粒体自噬机器。
科学价值： 1. 揭示了线粒体自噬启动的新颖调控层次： 首次明确了TBK1自身的泛素化（尤其是K63型）是其在线粒体自噬中发挥功能的关键激活步骤，补充了以往仅关注其磷酸化激活的认识。 2. 阐明了抗病毒蛋白在细胞质量控制中的“跨界”功能： 将两个经典的先天免疫蛋白（TRIM5α和TBK1）的功能，统一到了一个共同的细胞稳态维持通路——线粒体质量控制中，为理解先天免疫系统与细胞基础代谢/质量控制系统之间的进化与功能联系提供了直接证据。 3. 提出了TRIM蛋白介导选择性自噬的通用模型雏形： “TRIM-泛素-TBK1”调控轴的发现，为理解其他TRIM家族成员如何参与不同底物的选择性自噬（如异源自噬、aggrephagy等）提供了一个可能普适的机制框架。研究暗示，不同的TRIM蛋白可能通过识别特定“危险信号”（如病毒衣壳、受损细胞器），然后通过类似的泛素化-TBK1激活轴来启动相应的自噬清除程序。 4. 深化了对泛素化信号复杂性的理解： 展示了同一种修饰（K63泛素化）在同一蛋白（TBK1）上，在不同细胞语境（抗病毒信号 vs. 线粒体自噬）下可能介导不同的下游效应，强调了细胞微环境对信号解读的重要性。
应用价值与启示： 1. 疾病机制新视角： 与TRIM5α和TBK1相关的代谢、心血管疾病风险，可能部分源于其在细胞（特别是心肌、神经等线粒体丰富细胞）线粒体质量控制中的功能异常。这为相关疾病的病理机制研究和药物靶点开发提供了新方向。 2. 治疗策略新靶点： TRIM5α-TBK1相互作用界面、TBK1的K30/K401泛素化位点，或可作为调节线粒体自噬活性的潜在药物干预靶点，用于治疗因线粒体自噬缺陷引起的相关疾病。 3. 抗病毒与细胞稳态的平衡： 研究提示，在病毒感染（可能激活TRIM5α/TBK1的抗病毒通路）和细胞器损伤（激活其线粒体自噬通路）同时存在时，细胞需要精细平衡这两条通路。理解这种平衡机制可能有助于开发更安全的抗病毒或抗炎疗法。
研究亮点
这项研究不仅增进了我们对线粒体自噬这一基本生命过程分子机制的理解，也拓宽了对抗病毒蛋白功能多样性的认识，为相关疾病的机制研究和治疗探索开辟了新的道路。