关于“Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths”研究的学术报告

一、 研究作者、机构与发表信息

本研究由江南大学未来食品科学中心、江南大学生物技术学院教育部糖化学与生物技术重点实验室以及江南大学生物技术学院教育部工业生物技术重点实验室的研究团队共同完成。主要作者包括Wenjie Zuo, Guobin Yin, Luyao Zhang, Weijiao Zhang, Ruirui Xu, Yang Wang, Jianghua Li以及通讯作者Zhen Kang。该研究以原创研究文章（Original Research Article）的形式发表于期刊 Synthetic and Systems Biotechnology 第10卷（2025年），文章于2024年8月8日在线发布，最终于2024年8月7日被接受。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于合成生物学（Synthetic Biology）领域，具体聚焦于基因表达调控的核心工具——启动子（Promoter）的工程化设计与构建。启动子是控制基因转录起始的关键DNA序列，其强度与特异性直接决定了目标基因的表达水平，是构建高效微生物细胞工厂、实现代谢途径精准调控的基础。

随着合成生物学的发展，可用于生物制造的底盘细胞（Chassis Cells）种类日益多样化，包括大肠杆菌（*Escherichia coli*）、枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）、谷氨酸棒杆菌（*Corynebacterium glutamicum*）、酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）和毕赤酵母（*Pichia pastoris*）等原核与真核微生物。然而，目前绝大多数经过工程化改造的遗传调控系统（如启动子）具有高度的宿主特异性。这意味着，针对一种宿主（如大肠杆菌）优化设计的启动子，往往在其他宿主（如酵母）中无法有效工作。这种局限性使得研究人员在尝试将同一代谢途径或基因回路在不同宿主间转移、测试或优化时，需要为每种宿主重新设计和筛选适配的启动子，过程繁琐且效率低下。

因此，开发具有广泛宿主适应性的“广谱”或“跨物种”启动子（Cross-species promoters），成为合成生物学工具开发中的一个迫切需求。这类通用型启动子能够简化多宿主间的基因表达测试流程，加速最佳生产宿主的筛选，并推动合成生物学元件的标准化。尽管已有研究尝试构建适用于两到三种宿主的广谱启动子（如作者团队此前开发的PBS启动子），但能够同时覆盖上述五种重要工业微生物（特别是包含毕赤酵母和谷氨酸棒杆菌）且具有不同转录强度的跨物种启动子库尚未见报道。

基于此背景，本研究旨在通过对来自上述五种模式微生物的天然内源启动子的核心结构进行分析，并通过理性设计与组合改造其关键功能模体（Motif），开发出一系列（一个系列）能够在原核和真核五种不同微生物底盘细胞中均具有转录活性的新型人工跨物种启动子（命名为PSH系列）。该研究不仅旨在扩展合成生物学的启动子工具箱，更希望通过整合原核与真核启动子的关键元件，为未来通用型生物元件的标准化开发提供新的策略和思路。

三、 详细研究流程与方法

本研究遵循了一个系统性的工程化设计流程，主要包含以下几个关键步骤：

步骤一：优化原核启动子元件——UP元件的构建与筛选 首先，研究针对其前期开发的广谱启动子PBS在大肠杆菌中的活性进行了增强优化。策略是引入“UP元件”（UP element）。UP元件是位于转录起始位点上游约-45至-60 bp的一段序列，能够与RNA聚合酶的α亚基羧基末端结构域（αCTD）结合，增强RNA聚合酶对启动子的识别与结合，从而提升转录活性。 1. 对象与处理：研究人员选择了6个已知能增强启动子活性的UP序列（UP1-UP6），其中部分来源于天然基因（如rrnD, rybB, *rpoE*），部分为人工合成的共有序列。将这些UP序列分别插入到PBS启动子的上游。 2. 实验方法：通过构建含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的质粒，在大肠杆菌中检测改造后启动子的活性（荧光强度/OD600）。结果显示，UP4和UP6能显著提升PBS的活性。 3. 创新方法：基于UP4和UP6的序列，研究人员设计了一个UP元件突变库（序列通式为5’-NNANATGANGATCAAAANANANNCNNNNN-3’）。利用流式细胞分选技术（Flow Cytometry Screening），从该库中筛选出荧光强度最高的细胞群体（前0.1%）。将这些细胞在96孔板中培养并进行荧光复测，最终通过测序获得了30个高活性的UP突变序列。其中活性最高的三个（UP-G1, UP-G2, UP-G3）被用于后续构建。

步骤二：升级启动子骨架——整合σ因子结合位点 为了进一步提升PBS启动子在多种原核宿主中的活性和普适性，研究尝试在启动子骨架中整合额外的细菌σ因子（Sigma factor）识别位点。σ因子是RNA聚合酶识别特定启动子序列的关键亚基，不同σ因子识别不同的保守序列。 1. 理性设计：研究人员分析了不同细菌σ因子的识别序列。他们在PBS启动子骨架的基础上，引入了来自大肠杆菌的σ54因子识别位点（置于上游），并将枯草芽孢杆菌的σB和σD因子的识别序列整合到PBS原有的TATA-N30区域中。通过这种方式，创造了一个新的启动子骨架，命名为PST。 2. 实验验证：将PST启动子控制GFP表达的质粒转入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中，检测其活性。结果表明，与原始的PBS相比，PST在三种细菌中的荧光表达均显著增强，在枯草芽孢杆菌中提升高达300%，在大肠杆菌中提升约200%，在谷氨酸棒杆菌中也提升了约60%。这证明了通过理性添加多源σ因子识别位点，可以有效拓宽和增强启动子在原核宿主中的功能。

步骤三：设计真核启动子元件——上游激活序列（UAS）的工程化 为了使启动子能在真核宿主（酿酒酵母和毕赤酵母）中高效工作，需要优化其真核元件部分，核心是上游激活序列（Upstream Activating Sequence, UAS）。UAS是转录因子（Transcription Factor, TF）的结合位点，能招募转录机器，增强核心启动子的转录效率。 1. 天然启动子分析与转录因子结合位点（TFBS）鉴定：首先，研究人员测试了酿酒酵母的TDH3启动子和毕赤酵母的GAP、GCW14、AOX1核心启动子在这两种酵母中的交叉活性，发现天然启动子在自身宿主中活性更强，推测与宿主特异的TFBS有关。 2. 数据挖掘与序列组合：利用酵母转录调控比较基因组学数据库Yeastract+，他们从上述天然启动子序列中预测并筛选出了11个可能起激活作用的TFBS保守序列（涉及Sip4、Gcr2、Abf1等多种转录因子）。 3. 创新算法：为了高效地将多个TFBS组合成一个紧凑的UAS模块，研究团队开发了一个简单的“最小附加序列算法”（Minimum Annexation Sequence Algorithm）。该算法旨在最大化TFBS的信息密度，将筛选出的11个TFBS序列进行排列组合与连接，生成了11个长度在25到109个核苷酸之间的人工UAS组件（命名为UAS1-UAS11）。 4. 活性测试：将这些人工UAS组件分别连接到PBS启动子的上游，并在酿酒酵母和毕赤酵母中测试其增强GFP表达的能力。结果显示，UAS2、UAS4、UAS5在毕赤酵母中表现优异，而UAS10和UAS11在酿酒酵母中活性最强。

步骤四：组装与测试跨物种启动子（PSH系列） 这是整个研究的核心整合步骤。 1. 组合组装：研究人员将前三步获得的最佳元件进行组合装配：以升级后的PST启动子骨架为核心，在其上游分别连接筛选出的高活性UP元件（UP-G1, UP-G2, UP-G3）和优选的人工UAS组件（UAS2, UAS4, UAS5, UAS10, UAS11）。这产生了15种初始组合。 2. 初步筛选与RBS融合：通过初步活性测试，从15种组合中筛选出在酵母中表现最好的8种启动子序列（如2S2, 2S3, 4S2等）。为了进一步优化翻译起始效率，在这8种启动子的3’末端融合了一个通用的核糖体结合位点（Ribosome Binding Site, RBS）序列（5’-AAGGAGGTCTGCAATA-3’，其中包含酵母的Kozak序列）。 3. 最终验证：最终得到的8个跨物种启动子被命名为PSH1至PSH8。研究人员将这8个PSH启动子分别导入五种目标微生物（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母）中，通过荧光显微镜观察和定量荧光检测，系统评估了它们在所有宿主中的表达活性。同时，与各宿主常用的强启动子（如大肠杆菌的J23100、枯草芽孢杆菌的P43、酿酒酵母的TEF1、毕赤酵母的GAP等）以及骨架启动子PST进行了对比。

四、 主要研究结果

1. UP元件优化成功提升原核活性：通过流式细胞术筛选获得的UP-G1、UP-G2、UP-G3元件，能有效增强PBS启动子在大肠杆菌中的活性，为构建强活性跨物种启动子提供了有效的上游增强子。
2. PST骨架显著增强多原核宿主表达：整合了σ54、σB和σD识别位点的PST启动子骨架，相比PBS，在三种测试的原核细菌中荧光表达强度均大幅提升（60%-300%）。这证明通过理性叠加多源σ因子结合位点，可以构建出在原核界内具有广谱强活性的启动子核心框架。
3. 人工UAS组件有效增强真核表达：通过算法组合TFBS生成的人工UAS组件，能够显著提升核心启动子在酵母中的活性。不同的UAS组合在不同酵母中表现出偏好性，例如UAS5在毕赤酵母中效果突出，而UAS11在酿酒酵母中活性最强。这表明通过理性组合TFBS，可以定制化地调节启动子在特定真核宿主中的强度。
4. PSH系列启动子实现真正的跨物种功能：最终构建的PSH1-PSH8系列启动子，在所有五种测试微生物中均检测到了明显的GFP荧光信号，证实了它们具有跨物种（原核与真核）的转录活性。这是本研究最关键的成果。
5. 活性强度达到实用水平：定量数据显示，PSH系列启动子在各种宿主中的活性强度达到了与常用宿主特异性启动子可比甚至更优的水平。例如，PSH7在毕赤酵母中的活性达到了内源强启动子PGAP的120%；在酿酒酵母中，部分PSH启动子的活性可达强启动子PTEF1的50%；在大肠杆菌中，其活性远超常见的J23100启动子。这表明PSH启动子不仅是“有活性”，而且具备了在实际应用中驱动基因高水平表达的潜力。
6. 稳定性验证：通过长达14天的毕赤酵母连续发酵实验，研究人员证明了PSH启动子驱动GFP表达的稳定性，排除了其活性在长期培养中快速衰减的可能性，为其工业应用提供了初步依据。
7. 新转录因子结合位点的产生：通过分析在两种酵母中均表现优异的PSH3、PSH7、PSH8的序列，研究人员发现，人工组合UAS的过程可能产生了新的、未被初始列表包含的转录因子结合位点（如Gsm1, Pip2, Rgt1等），这可能是其获得高活性的原因之一，也为后续设计提供了新线索。

五、 研究结论与价值

本研究成功开发并验证了一个名为PSH的人工跨物种启动子系列，该系列启动子能够在五种重要的工业微生物（包括原核和真核）中驱动基因表达。这项工作通过理性工程化策略，将原核启动子的UP元件、多σ因子识别位点与真核启动子的转录因子结合位点（UAS）进行创新性整合，构建了兼具广谱性和一定强度可调性的通用型基因表达元件。

其科学价值在于：1）提供了跨物种启动子设计的新范式：证明了通过整合不同生物界别启动子的关键功能模体，可以创造出超越天然宿主限制的人工通用元件。2）深化了对启动子结构与功能关系的理解：研究通过模块化替换和组合，实证了UP元件、σ因子结合位点和UAS在决定启动子宿主范围与强度中的关键作用及可叠加性。3）拓展了合成生物学工具箱：PSH系列启动子为合成生物学提供了一个宝贵的标准化部件，可用于快速在不同宿主中测试和比较基因功能、代谢途径效率，加速最佳底盘细胞的筛选过程。

其应用价值显著：在构建微生物细胞工厂时，研究人员可以使用同一套PSH启动子在不同宿主中快速组装和测试代谢途径，无需为每种宿主重新优化启动子，极大地提高了“设计-构建-测试-学习”（DBTL）循环的效率。这尤其适用于需要从众多潜在宿主中筛选最佳生产菌株的场合，或是在多物种合成微生物群落中实现协调表达。

六、 研究亮点

1. 真正的“五宿主”跨物种活性：这是首个报道的能同时在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母这五种关键工业微生物中均具有功能活性的人工启动子系列，覆盖的宿主范围广，实用性强。
2. 理性设计与高通量筛选相结合的策略：研究并非完全依赖随机突变和筛选，而是基于对天然启动子结构的深刻理解进行理性设计（如引入特定σ因子位点），并在关键环节（如UP元件优化）辅以高通量流式细胞术筛选，提高了研发效率和成功率。
3. 模块化与组合式工程方法：研究将启动子分解为UP元件、核心骨架（含σ因子位点）和UAS模块，分别进行优化后再进行组合。这种模块化思路使得启动子的性能可以像搭积木一样进行定制和调整。
4. 创新性算法工具的应用：开发了“最小附加序列算法”用于高效组合多个转录因子结合位点，生成紧凑而高效的人工UAS，该方法可推广用于其他真核启动子的工程化改造。
5. 为标准化和自动化奠定基础：PSH这类通用型元件的成功开发，是朝着合成生物学元件标准化和生物系统自动化构建迈出的重要一步，有助于实现遗传线路在不同底盘间的“即插即用”。

七、 其他有价值的内容

研究在讨论部分展望了未来的研究方向，包括：1）进一步扩展真核启动子元件的多样性，并在不同培养条件下测试启动子性能；2）结合内部核糖体进入位点（IRES）、2A肽序列等工具，探索在真核宿主中实现多顺反子表达的可能性，从而进一步扩大跨物种启动子的应用场景；3）利用机器学习方法分析高通量数据，建立综合考虑活性、序列长度、宿主适用性等参数的跨物种启动子设计算法，实现更智能、更高效的启动子从头设计。这些展望指出了该领域未来的发展趋势，即将湿实验（Wet Lab）与计算分析（Dry Lab）深度融合，以设计出更全面、更标准化的基因表达系统。