关于《Engineering a Robust Cas12i3 Variant-Mediated Wheat Genome Editing System》研究的完整报告

作者与研究背景

本文作者包括 Wenxue Wang、Lei Yan、Jingying Li、Chen Zhang、Yubing He、Shaoya Li 和 Lanqin Xia，分别隶属于中国农业科学院作物科学研究所（国家作物种质资源与育种重点实验室）及国家南繁研究院（海南种业实验室）。该研究发表在《Plant Biotechnology Journal》期刊上，接收日期为2024年11月23日。

本研究的学术背景聚焦于小麦作为全球最重要的基础粮食作物之一的基因组编辑领域。随着全球气候变暖、极端天气频发、人口增长以及水资源短缺的加剧，未来的小麦生产将面临巨大挑战。尤其是在小麦六倍体基因组（2n = 6x = 42, AABBDD）背景下，由于基因冗余和转化效率较低，目前基因组编辑的效率不高。本研究旨在开发一种稳健的Cas12i3变体（Cas12i3-5m）体系，并通过优化的技术方案来提高小麦基因组编辑的效率，为小麦生物学研究及遗传改良提供新的工具。

研究目标

研究的总体目标在于通过工程化改造，发展一种稳健的小麦基因组编辑技术。具体来说，研究尝试结合T5外切酶（T5 exonuclease, T5E）融合策略及优化的crRNA表达方案（OPT）以提升基因编辑效率，同时评估该技术体系在不同小麦品种中的可应用性。

研究详细流程

第一阶段：基因编辑工具优化

研究首先在哺乳动物HEK293T细胞中测试了Cas12i3-5m的性能。作者分别通过融合T5E和ExoI两种外切酶到Cas12i3-5m的N端，并对不同构型进行编辑效率的测试。实验中通过荧光报告系统定量分析三种小麦基因的编辑效率。这些基因包括： - TaARE1-D：与提高氮利用率和产量有关； - TaHRC-D：其突变可提高小麦抗穗腐病能力； - TaSBEIIa：该基因对淀粉组成和性能具有决定性作用，其突变可产生高抗性淀粉的小麦。

研究结果表明，与Cas12i3和未经修饰的Cas12i3-5m相比，融合了T5E的Cas12i3-5m的编辑效率显著提高，分别达到1.34倍和3.87倍。

第二阶段：小麦中Cas12i3/Cas12i3-5m体系的验证

基于HEK293T细胞中的初步试验结果，作者进一步在小麦稳定遗传系中验证上述工具的性能。同样以TaARE1、TaHRC和TaSBEIIa为靶点，构建了常规版（tau3驱动crRNA表达）和优化版（OPT策略，35S-CmYLCV-U6复合启动子驱动crRNA表达）的Cas12i3、Cas12i3-5m和T5E-fusion-Cas12i3-5m三种体系。

结果表明，常规策略下Cas12i3和Cas12i3-5m无法在任何靶点检测到编辑效应，而T5E-Cas12i3-5m的编辑效率也较低，仅在TaARE1靶点检测到10%-33%的平均效率。

优化后的OPT策略显著提高了T5E-Cas12i3-5m的编辑效率。该体系在三个靶基因位点上的编辑效率范围从60.71%到90.00%不等，且在不同小麦品种（如ZM7698、ZM1860、ZS9170）中的应用效果一致。

主要研究结果

1. T5E的加入显著提高了编辑效率：
   在HEK293T细胞中，T5E-Cas12i3-5m相比未优化的Cas12i3-5m，其基因编辑效率提高了约1.34-3.87倍。这表明通过T5E促进DNA切口端降解进而引导错误修复（error-prone NHEJ）路径的策略是有效的。

2. 优化的crRNA表达策略（OPT）对编辑效率的提升贡献最大：
   在小麦稳定遗传系中，OPT-T5E-Cas12i3-5m体系的平均编辑效率（例如，在TaHRC位点达到约89%）显著高于OPT-Cas12i3-5m（66.87%）和OPT-Cas12i3（11.2%）。

3. 编辑后的基因型分析：
   对突变小麦植株的基因型进行测序发现，OPT-T5E-Cas12i3-5m不仅提高了编辑效率，还增加了较大删除片段的比例（多达66.67%的删除超过31 bp）。较大删除可有效防止错误修复路径重新连接，提升编辑准确性和实用性。

4. 性能的通用性验证：
   OPT-T5E-Cas12i3-5m体系在不同小麦品种（ZM1860和ZS9170）中表现出一致的编辑效率，表明该策略具有良好的普适性。

5. 突变的稳定性及遗传性：
   T1代突变体的分子和表型验证表明突变可以稳定遗传，且符合孟德尔分离规律。此外，通过PCR检测获得了无转基因成分的T1纯合突变系。

研究意义与亮点

意义

• 科学价值：
  本研究首次报道了将Cas12i3-5m成功应用于复杂且具有六倍体基因组的小麦基因组编辑中，并显著提升了编辑效率。
• 应用价值：
  开发出的OPT-T5E-Cas12i3-5m系统为小麦及其他多倍体作物（如大麦、燕麦等）的基因组编辑提供了一个高效且实用的新工具。

亮点

1. Cas12i3相比于传统的SpCas9，其靶点范围更广（TTN PAM位点）。
2. 探索了T5E融合及优化crRNA表达策略的联合应用，这一系统性优化显著提高了编辑效率。
3. 开发的策略可通过较大的突变删除有效应对多倍体作物的同源重连难题。
4. 突变的传输稳定性验证为在田间应用提供了可靠的基础。

今后的发展方向

在未来，为进一步提高编辑效率并降低脱靶效应，研究者建议系统测试其他外切酶融合形式，以及探究Cas12i3-5m的更大范围适用潜力。本研究也为后续整合基因敲入或更高效的多基因编辑工具开发提供了方向。