CRISPR-Cas9载体在芽孢杆菌遗传修饰中的应用研究

作者与机构
本研究由Anna A. Toymentseva和Josef Altenbuchner合作完成，两人均来自德国斯图加特大学工业遗传学研究所（Institut für Industrielle Genetik, Universität Stuttgart）。研究发表于学术期刊《FEMS Microbiology Letters》，具体发表日期为2018年12月8日。

学术背景
本研究属于微生物遗传工程领域，重点关注CRISPR-Cas9技术在芽孢杆菌（Bacillus species）基因组编辑中的应用。CRISPR-Cas系统作为一种适应性免疫机制，近年来被广泛用于细菌、植物和动物细胞的精准基因编辑。然而，芽孢杆菌作为工业和生产中的重要微生物，其遗传操作仍面临宿主范围限制、转化效率低等问题。因此，本研究旨在开发新型CRISPR-Cas9载体，以提高芽孢杆菌基因组编辑的效率和通用性。

研究背景知识包括：
1. CRISPR-Cas系统：由Cas9核酸酶和向导RNA（sgRNA）组成，通过识别PAM序列（原间隔相邻基序，protospacer adjacent motif）靶向切割DNA。
2. 芽孢杆菌的遗传特性：传统方法（如同源重组）效率低，且部分菌株难以转化。
3. 现有载体局限性：多数载体依赖宿主特异性启动子（如甘露糖诱导型启动子pManPA），限制了跨物种应用。

研究目标包括：
1. 开发适用于广宿主范围的CRISPR-Cas9载体；
2. 评估Cas9核酸酶与Cas9切口酶（Cas9 nickase, Cas9n）的编辑效率差异；
3. 验证非同源末端连接（NHEJ）在芽孢杆菌中的活性；
4. 建立基于接合转移（conjugation）的载体递送方法。

研究流程
1. 载体构建
- 基础载体：以pjoe8999为骨架，包含温度敏感型复制子（pE194ts）和甘露糖诱导型Cas9表达系统。
- 启动子替换：将pManPA替换为木糖诱导型启动子（xylR-pxylA）和四环素诱导型核糖开关（ptetLM-tetLM），构建载体pjoe9297.1和pjoe9695.1。
- Cas9n载体：将Cas9的D10A突变体（Cas9n）插入pjoe9611.1，需双sgRNA靶向删除大片段基因组。

1. 转化与编辑效率测试

   • 研究对象：以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）reg19菌株为模型，目标为删除25.1 kb的基因组区域（ΔyceB-ycgg）。
     
   • 实验设计：比较不同载体（pManPA、xylR-pxylA、ptetLM-tetLM调控的Cas9及Cas9n）的转化效率和编辑成功率。
     
   • 结果：
     
     • pManPA-Cas9编辑效率达93%（99个克隆中92个成功）；
       
     • xylR-pxylA-Cas9效率最高（97%），转化效率为647±179转化子/μg DNA；
       
     • ptetLM-tetLM-Cas9因质粒过大（>11 kb）和基础表达毒性导致转化效率最低（15±5转化子/μg DNA）；
       
     • Cas9n无细胞毒性，但编辑效率仅为53%。
       

2. NHEJ活性验证

   • 实验设计：通过pjoe9430.1载体靶向amyE基因，分析192个克隆的修复模式。
     
   • 结果：191个克隆通过同源重组（HR）修复，仅1个未突变克隆可能因Cas9失活。表明枯草芽孢杆菌在生长期无NHEJ活性。
     

3. 接合转移优化

   • 方法：在载体中插入oriT/traJ区域（来自pkVM5），利用大肠杆菌S17-1（含RP4接合系统）与枯草芽孢杆菌JA-BS33（无自然转化能力）接合。
     
   • 效率：接合转移效率达10⁻²–10⁻³，高于传统转化法。
     

主要结果与逻辑关系
1. 广宿主载体开发：木糖和四环素调控系统的成功构建（pjoe9297.1和pjoe9695.1）为其他芽孢杆菌提供了通用工具。
2. Cas9n的局限性：虽无毒性，但低效率和多步克隆限制了其应用（需双sgRNA和四次克隆步骤）。
3. NHEJ的缺失：支持了芽孢杆菌依赖HR修复的结论，减少了脱靶风险。
4. 接合转移的实用性：为难以转化的菌株提供了高效递送方案。

结论与价值
1. 科学价值：
- 扩展了CRISPR-Cas9在芽孢杆菌中的调控选项（木糖、四环素系统）；
- 明确了NHEJ在枯草芽孢杆菌中的非活性状态，为精准编辑提供理论依据。
2. 应用价值：
- 新载体可用于工业菌株的快速改造（如生产酶类或抗生素）；
- 接合转移方法适用于无自然转化能力的菌株。

研究亮点
1. 创新载体设计：首次在芽孢杆菌中整合木糖和四环素诱导系统，突破宿主限制。
2. 高效编辑：最高97%的删除效率为大规模基因组操作奠定基础。
3. 技术优化：接合转移的引入解决了转化难题。

其他有价值内容
- 研究中发现ptetLM-tetLM系统的松弛调控可能导致Cas9基础表达毒性，提示严格调控启动子的重要性。
- 补充数据中详细列出了所有质粒和菌株的构建方法，为后续研究提供参考模板。

（注：术语翻译示例：CRISPR-Cas9=成簇规律间隔短回文重复序列-关联蛋白9；NHEJ=非同源末端连接；HR=同源重组；sgRNA=单链向导RNA。）