膜电位动力学揭示生物电抗菌敏感性测试在抗真菌筛选中的应用前景
本研究由Tailise Carolina de Souza-Guerreiro、Letícia Huan Bacellar、Thyerre Santana da Costa、Conor L. A. Edwards、Ljubica Tasic和Munehiro Asally等人完成。主要研究机构包括英国华威大学生命科学学院（School of Life Sciences, University of Warwick）、华威整合合成生物学中心（Warwick Integrative Synthetic Biology Centre）、巴西坎皮纳斯大学化学研究所生物化学实验室（Institute of Chemistry, Biological Chemistry Laboratory, University of Campinas）以及Cytecom有限公司。该研究于2024年7月23日发表在mBio期刊上（2024年8月第15卷第8期），论文DOI为10.1128/mbio.01302-24。
膜电位（membrane potential）作为细胞功能的基础标志物，在抗菌敏感性测试（antimicrobial susceptibility testing, AST）中具有重要价值。活细胞通过维持内外离子浓度差异产生跨膜电位梯度，这种电位不仅是离子动力（ion motive force）的组成部分，还为膜转运和ATP合成等过程提供自由能，因此对细胞稳态和生物能量学至关重要。膜电位已被用作细胞增殖能力（cell vitality）的指示器，在微生物感染诊断、增殖细胞检测和合成生物学基因回路检验等生物医学应用中具有核心地位。然而，由于微生物膜电位测量技术的困难，其广泛应用受到限制。近年来，真菌对人类和生态系统健康的威胁不断增加，抗微生物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）病例持续上升。传统的抗真菌敏感性测试方案耗时耗力，构成了应对AMR的实际障碍。在此背景下，本研究提出了生物电抗菌敏感性测试（Bioelectrical AST, BEAST）方法，利用模式生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）探索电刺激诱导的膜电位动力学作为抗真菌化合物筛选的新途径。
研究团队在方法上结合了荧光显微成像、时延显微镜（time-lapse microscopy）和数学建模。实验使用三种荧光膜电位指示剂：DiBAC4(3)用于检测质膜电位，TMRM用于线粒体膜电位，ThT作为阳离子染料同时具有膜电位指示功能。首先对三种染料在实验体系中的特性进行了表征，发现DiBAC4(3)定位于质膜，TMRM定位于线粒体，而ThT在线粒体中积累但信号较TMRM弥散。通过10 µM的质子解偶联剂CCCP（carbonyl cyanide chloro phenylhydrazone）处理验证，TMRM和ThT信号均显著下降，而DiBAC4(3)信号无显著变化，证实了染料对相应膜电位区域的响应特异性。
电刺激实验采用金镀层电极皿，将载有酵母细胞的YNB琼脂糖垫置于电极上，施加±1.5 V、100 Hz的交流电刺激2.5秒。刺激后，DiBAC4(3)信号在20分钟内下降约25%，表明质膜发生超极化（hyperpolarization）；ThT信号上升约3倍，进一步支持质膜超极化的结论；而TMRM信号迅速下降，提示线粒体膜发生去极化（depolarization）。未施加电刺激的对照组在20分钟时延实验中荧光信号无显著变化。
为探究细胞活力与电诱导膜电位动力学的关系，研究采用了UV-紫光局部照射方法，在同一视野内生成受抑制和未受抑制的细胞群体，确保两组接受完全相同的电刺激条件。UV照射后通过明场时延显微镜确认受照射细胞停止生长。电刺激结果显示，未照射细胞表现出典型的超极化响应，而UV抑制的细胞中DiBAC4(3)信号上升约50%（去极化），ThT信号则表现为轻微瞬时下降后基本持平，表明受抑制细胞无法产生电刺激诱导的超极化响应。乙醇处理的应激细胞同样表现出质膜去极化而非超极化。TMRM信号在照射与未照射细胞间无显著差异，这可能是因为线粒体膜受质膜绝缘保护，未被外部电场直接作用。
研究进一步采用FitzHugh-Nagumo（FHN）数学模型对活力依赖的超极化动力学进行数值模拟。模型中参数k代表细胞活力，影响静息膜电位水平和动力学时间尺度。模拟结果显示，较小的k值对应较弱的超极化响应，预测了膜电位动力学幅度与抑制程度的相关性。为验证这一预测，研究使用不同浓度CCCP（0至100 µM）处理细胞，观察剂量依赖性的生长抑制效应：40 µM和100 µM CCCP分别使生长速率降低约50%和90%。通过ThT荧光时延显微镜测定电刺激后20分钟的质膜电位动力学幅度（PMD20），发现PMD20随CCCP浓度增加而降低。将PMD20与生长速率作图，两者呈现显著正相关（Spearman r = 0.89，P = 0.019），证实了膜电位动力学可作为评估抗真菌活性的有效指标。
为测试BEAST在新型抗真菌化合物筛选中的应用潜力，研究采用了生物合成银纳米颗粒（biogenic silver nanoparticles, bioAgNPs）。这些纳米颗粒分别利用橙皮类黄酮（橘皮素hesperetin, HST和橙皮苷hesperedin, HSD）以及尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）合成。电子显微镜、光谱学和动态光散射表征确认了纳米颗粒的基本性质：平均直径约25-30 nm，zeta电位约-35 mV，多分散度约0.4。将酵母细胞与不同bioAgNPs孵育后测定PMD20，结果发现AgNP-FU和AgNP-HST处理组的PMD20显著降低，其生长抑制效果强于AgNP-HSD。PMD20结果与过夜平板读数器（plate-reader）测定的生长速率抑制效果一致，表明BEAST能够在数小时内完成对新型抗真菌化合物活性的评估，而传统生长测定需要过夜。
本研究具有多重科学价值和应用意义。在科学层面，研究首次在真核生物中证明了电刺激诱导质膜超极化响应与细胞增殖能力的关联，将此前在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌（Escherichia coli）中发现的细菌电生理学现象拓展至真核模式生物，提示这种膜电位动力学可能是一个进化保守的特征。研究还建立了BEAST方法，结合时延显微术和数学建模，为微生物电生理学提供了新的研究范式。在应用层面，BEAST能够在数小时内评估抗真菌化合物的生长抑制效果，显著缩短传统AST所需时间，尤其适用于新型抗微生物化合物的快速筛选。考虑到酿酒酵母在生物技术过程中的广泛应用（从酿造烘焙到药物分子生产），以及工业环境中酵母和霉菌污染导致的9%非食品产品召回，BEAST在工业质量控制和临床诊断中均具有广阔的应用前景。研究还展示了利用橙皮废弃物合成生物银纳米颗粒的经济与生态优势，为绿色纳米材料制备提供了途径。
本研究的亮点包括：首次在真核微生物中建立电刺激诱导膜电位动力学与细胞活力的定量关联；开发了结合多荧光探针成像与FHN数学模型的分析流程；展示了BEAST方法独立于抗菌剂分子作用模式的普适性评估能力；以及利用生物合成银纳米颗粒验证了BEAST在实际抗真菌筛选中的可行性。未来研究需要进一步探究电刺激触发的精确分子机制，并在临床相关真菌物种中验证BEAST的适用性。