这是一篇发表于1998年10月19日《The Journal of Cell Biology》期刊上的原始研究论文，题为《The dynamin-related GTPase, Dnm1p, controls mitochondrial morphology in yeast》。该研究由犹他大学生物学系的Denichiro Otsuga、Brian R. Keegan、Ellen Brisch、John W. Thatcher、Greg J. Hermann、William Bleazard以及Janet M. Shaw共同完成，其中Denichiro Otsuga与Brian R. Keegan为共同第一作者，通讯作者为Janet M. Shaw。

该研究属于细胞生物学与线粒体生物学领域，聚焦于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中线粒体形态维持的分子机制。线粒体在真核细胞中主要负责产生ATP，其形态与分布在多种细胞类型中呈现高度特化，以满足不同的能量需求。在芽殖酵母中，线粒体形成一种高度分支的管状网络，分布于细胞皮层的周围细胞质中。此前的研究已发现多个参与维持该网络形态的基因，如MMM1、MDM10、MDM12、MGM1和FZO1等。然而，驱动线粒体管状网络在细胞皮层均匀分布的分子机制仍不清楚。Dnm1p是酵母中三种与动力蛋白（dynamin）相关的GTP酶之一。哺乳动物dynamin在网格蛋白（clathrin）包被小窝的颈部组装成环状结构，通过GTP水解促进膜分裂从而释放内吞囊泡。但酵母DNM1突变并不阻断内吞作用，其体内的确切功能一直不明确。该研究旨在揭示Dnm1p在酵母细胞内的生理功能，尤其是其是否参与线粒体形态与分布的调控。

研究的工作流程可以从以下几个方面进行详细阐述。首先，研究团队通过经典遗传学方法将先前分离得到的线粒体形态异常突变体mdm29-1定位到第十二号染色体着丝粒附近区域，并通过互补分析和减数分裂连锁分析证明MDM29与DNM1为同一基因。对mdm29-1和mdm29-2突变等位基因进行测序发现，mdm29-1在第120位氨基酸后产生截短，破坏了N端GTP酶结构域；mdm29-2则缺失了C端最后26个氨基酸。随后，研究者构建了DNM1基因完全缺失的dnm1Δ菌株，并将其表型与mdm29突变体进行比较。在表型鉴定方面，研究人员使用cox4-GFP融合蛋白标记线粒体基质、DiOC6染色检测线粒体膜电位、DAPI染色观察线粒体DNA类核，以及透射电子显微镜观察线粒体超微结构。为了确定线粒体形态缺陷的特异性，研究还检查了其他细胞器的形态，包括内质网（使用抗Kar2p抗体免疫荧光）、高尔基体（使用Sec7p-EGFP标记）、液泡（使用FM 4-64染色）、肌动蛋白骨架（使用罗丹明-鬼笔环肽）和微管骨架（使用抗微管蛋白抗体）。此外，研究使用内吞作用突变体end3、end4、vps4、vps18和pan1来检验内吞缺陷是否会导致线粒体形态异常，并以FM 4-64内化动力学实验直接检测dnm1Δ细胞的内吞功能。

在Dnm1p功能调控研究方面，研究者构建了由GAL1启动子控制DNM1表达的菌株，通过改变碳源在转录水平诱导或关闭DNM1表达，并在不同时间点定量线粒体形态变化和Dnm1p蛋白水平。为了验证GTP酶结构域的功能，研究对预测的GTP结合结构域进行了定点突变，包括G1基序中的K41A和S42N突变、位于G2基序的T62A突变，以及删除整个N端GTP结合结构域（ΔGTPase，缺失第8至338位氨基酸）。这些突变体被构建到低拷贝（pRU1）和高拷贝（YEp213）质粒中，分别导入野生型、dnm1Δ和GAL1-DNM1菌株，通过DiOC6染色定量线粒体形态恢复或显性干扰效果。在Dnm1p亚细胞定位方面，研究构建了在C端插入3个HA表位的DNM1-HA融合蛋白，并用抗HA抗体和抗Dnm1p多克隆抗体进行间接免疫荧光检测，同时以cox4-GFP标记线粒体网络，通过共聚焦显微镜评估共定位程度。研究还在mdm10突变体（线粒体呈巨大球状）中检测Dnm1p-HA的定位，以判断Dnm1p与线粒体结合的依赖性。生化分馏实验方面，研究者采用差速离心法将细胞裂解物分为P10,000线粒体富集沉淀和S10,000上清，再用蔗糖密度梯度离心进一步分离P10,000中的膜组分，通过Western blotting检测Dnm1p与线粒体外膜蛋白porin、内质网标记Dol-P-Man synthase、高尔基体标记Mnn1p、液泡标记ALP和质膜标记Gas1p的共分馏情况。此外，还用0.1 M碳酸钠（pH 11.5）和Triton X-100处理线粒体沉淀，以判断Dnm1p与膜的结合性质。

研究获得了以下主要结果。在dnm1Δ突变体中，野生型的管状线粒体网络塌缩至细胞一侧，形成拉长的管状结构，但仍位于细胞皮层并保留线粒体DNA类核。透射电镜显示这些异常线粒体具有正常的嵴结构，并且通常相互连接或分支。尽管形态异常，这些线粒体仍能被DiOC6染色，表明其具有膜电位；cox4-GFP能够被正常输入基质，说明蛋白质输入机制基本正常；且dnm1突变体在甘油、乳酸等非发酵碳源上生长正常。其他细胞器如细胞核、内质网、高尔基体和液泡的形态均未受明显影响，肌动蛋白和微管骨架的排列也保持正常。在GAL1启动子调控实验中，当DNM1表达被关闭时，线粒体网络在60分钟内开始失去分支，随后塌缩为拉长结构；当重新诱导表达时，线粒体首先在细胞皮层延伸形成环状中间形态，继而恢复分支，最终在200分钟左右完全恢复野生型网络。这一形态变化与Dnm1p蛋白水平的增减密切相关。GTP酶结构域突变分析显示，K41A、S42N、T62A和ΔGTPase四种突变体均不能在dnm1Δ菌株中恢复线粒体形态，且在野生型细胞中表达这些突变体会导致显性的线粒体形态缺陷；但在过表达野生型Dnm1p的细胞中，这些突变体的显性干扰效应被完全抑制。FM 4-64内化实验表明，dnm1Δ细胞的内吞动力学与野生型完全一致，排除了线粒体形态缺陷由内吞障碍引起的可能性。此外，end3、end4、vps4、vps18和pan1等内吞突变体的线粒体形态均为野生型，进一步支持了这一结论。免疫荧光定位显示，Dnm1p以点状结构分布于细胞皮层，与线粒体网络的分支点、管状末端和侧面共定位，定量分析显示约85%的Dnm1p-HA点与线粒体网络重叠。在mdm10突变体中，约57%的Dnm1p-HA仍与巨大的球状线粒体相关联。生化分馏显示，一部分Dnm1p与线粒体膜共分馏，在蔗糖梯度中与porin一同出现在第15组分中；但大部分Dnm1p存在于可溶性胞质组分中。碳酸钠处理可完全将Dnm1p从膜组分中释放，表明其与线粒体膜的结合为外周膜蛋白式的非整合性结合。

基于上述结果，研究得出结论：Dnm1p是维持酵母线粒体管状网络皮层分布所必需的GTP酶，其N端GTP结合结构域对功能至关重要。Dnm1p在细胞皮层形成点状结构并与线粒体网络共定位，可能通过调控线粒体分支、分裂或作为锚定位点将线粒体网络均匀分布于细胞外周。该研究首次揭示了dynamin相关蛋白在调控线粒体形态与分布中的新功能，扩展了dynamin家族蛋白的细胞功能范畴。由于后续研究在哺乳动物中发现了Dnm1p的同源蛋白DRP1，且DRP1突变体同样引起线粒体形态异常，该研究为理解线粒体形态调控在进化上的保守机制奠定了基础，也为后续线粒体分裂机制的研究提供了关键线索。

该研究的亮点在于：首次明确证明Dnm1p的功能与线粒体形态维持直接相关，而非参与内吞作用；通过GTP酶结构域突变分析证明其GTP结合结构域的功能必要性；通过GAL1启动子可控表达实验建立了Dnm1p蛋白水平与线粒体形态动态变化之间的直接因果关系；并结合免疫荧光定位与生化分馏证明Dnm1p与线粒体存在直接或间接的关联。此外，研究还鉴定出Dnm1p第62位苏氨酸为功能性G2基序，为dynamin家族蛋白GTP酶结构域的功能分析提供了新的实验依据。