《自然·植物》刊发中国学者重大突破：保守DNA架构因子RDE协同叶绿体发育与细胞周期调控
中国科学院植物研究所、南京师范大学生命科学学院等机构的科研团队在植物光合作用与细胞周期协同调控领域取得重要突破。相关成果以“保守DNA架构因子耦合子叶发育中叶绿体发育与细胞周期”为题，于2026年在线发表于国际顶级学术期刊《自然·植物》（Nature Plants）。该研究由南京师范大学Wang Xiushun（王秀顺）、Zhang Zhao（张钊）、Cao Ting（曹婷）及中国科学院植物研究所An Wenjing（安文静）等学者共同完成，通讯作者为南京师范大学Chi Wei（迟伟）研究员。
一、研究背景与科学问题
植物器官生长依赖细胞增殖、扩展与分化的精密协调。真核生物中，E2F–DP–RB信号通路是控制细胞周期G1期向S期转变的核心调控模块：E2F–DP异源二聚体激活驱动细胞周期进程的基因转录，而视网膜母细胞瘤蛋白（RB）通过结合E2F–DP复合物抑制其活性。在植物中，E2F–DP活性升高不仅促进有丝分裂，还会触发核内再复制（endoreplication）——一种向多倍体转变的发育开关，促进细胞扩展与器官生长。然而，E2F–DP模块如何响应发育信号与环境信号整合到植物发育程序中，其分子机制长期未明。
叶绿体是绿色植物特有的细胞器，源于宿主细胞与蓝细菌的内共生事件。在单细胞藻类中，叶绿体分裂与细胞有丝分裂紧密偶联以保障细胞器遗传；但在多细胞植物中，细胞分裂往往伴随质体分化而非简单的叶绿体分裂。幼苗去黄化过程中的光形态建成即为此典范：光同时驱动黄化质体向光合功能叶绿体的分化以及子叶生长（主要通过细胞扩展）。这一光信号、质体分化与细胞周期调控的三元协同机制，始终是植物生物学中悬而未决的根本问题。
研究团队前期鉴定到DG1（delayed greening 1）基因，其编码叶绿体定位的五肽重复（PPR）蛋白，对叶绿体基因表达与发育至关重要。dg1突变体因质体分化受损而表现为子叶黄化。为寻找DG1的上游调控因子，研究者在dg1突变体背景下开展了遗传抑制子筛选，最终分离到多个抑制子株系。其中sug#2（suppressor of dg1 #2）为纯合双突变体，在原有dg1等位基因基础上携带第二个位点突变——位于RDE（regulator of DG1 expression，AT5G22080）基因第一内含子剪接受体位点的G-to-A替换。该突变破坏正常剪接，导致RDE蛋白功能丧失。遗传互补实验证实RDE等位基因（rde-1）的因果性；另一T-DNA插入等位基因（rde-2）同样使dg1 rde-2双突变体呈现野生型表型。值得注意的是，rde单突变体叶绿素含量高于野生型，表明RDE是叶绿体发育的负调控因子。亚细胞定位显示RDE严格定位于细胞核，其N端含DnaJ结构域，C端虽无已知功能域，但系统发育分析揭示RDE及其直系同源物仅存在于绿色植物（从绿藻到被子植物）中，在红藻与灰藻中缺失，提示其在绿色植物谱系中的独特进化起源。
二、研究流程与实验设计
本研究的实验流程可归纳为六大部分。第一，遗传筛选与基因鉴定。以dg1突变体为材料进行EMS（甲基磺酸乙酯）诱变，通过叶绿素荧光与叶色变化筛选抑制子；结合图位克隆与集群分离分析（BSA）测序，将因果突变定位到RDE基因；利用RT-PCR验证剪接异常，通过遗传互补与T-DNA等位基因进一步确认。第二，RDE调控叶绿体基因表达的功能分析。对rde-1突变体进行叶绿体基因组转录谱分析（79个叶绿体基因按功能分为九类），通过RT-qPCR检测转录水平；用免疫印迹检测叶绿体编码蛋白（包括核糖体蛋白RPL2、RPS2，RNA聚合酶RPOB、RPOC2及类囊体复合物亚基）的积累；采用林可霉素（lincomycin）抑制叶绿体翻译、诺氟拉松（norflurazon）干扰叶绿体发育的药理学实验区分RDE对基因表达的特异性调控；通过蛋白稳定性实验（阻断新合成后追踪降解动力学）区分合成增强与降解减缓。第三，光响应发育表型分析。检测暗转光过程中RDE转录与蛋白水平变化；测量去黄化过程中子叶叶绿素积累及DG1、psbA（编码光系统II D1亚基）的表达动态；定量子叶面积、栅栏组织细胞大小与细胞数目，区分细胞分裂与细胞扩展的贡献；在暗生长条件下平行分析细胞参数以验证光依赖性。第四，RDE与DPA的相互作用研究。通过酵母双杂交（Y2H）筛选25个候选互作核蛋白，独立验证后锁定TSA1与DPA；用双分子荧光互补（BiFC）在植物细胞内验证互作；用免疫共沉淀（Co-IP）与体外pull-down实验进一步确认；构建DPA截短体（DNA结合域53–133氨基酸、二聚化域140–249氨基酸）鉴定互作区域；竞争性pull-down实验检测RDE是否干扰E2FA–DPA复合物组装。第五，RDE调控细胞周期的遗传学分析。构建rde-1 dpa双突变体（CRISPR/Cas9编辑）；RT-qPCR检测S期基因表达；流式细胞术分析子叶核倍性分布；扫描电镜统计毛状体分支数作为核内再复制的形态学指标；测量双突变体子叶面积与细胞大小。第六，全基因组靶基因鉴定与转录调控机制。对rde-1突变体与E2FA-DPA过表达（e2fa-dpa-oe）植株进行RNA-seq比较转录组分析；利用RDE-GFP与DPA-GFP转基因材料进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）；GO富集分析鉴定共享靶基因；通过电泳迁移率变动实验（EMSA）检测RDE的体外DNA结合能力；T4连接酶介导的环化实验检测RDE诱导DNA弯曲的能力；双荧光素酶报告实验在拟南芥叶肉原生质体中检测RDE对E2FA–DPA转录活性的影响。
三、主要研究结果
（1）RDE通过多靶点调控叶绿体基因表达。rde-1突变体中叶绿体转录物整体上调，但呈现基因特异性模式。PEP依赖型转录物（编码光系统II、光系统I、细胞色素b6f及ATP合酶亚基）表达升高与DG1促进PEP转录活性的功能一致；但核糖体亚基、质体RNA聚合酶亚基、NAD(P)H脱氢酶复合物亚基及功能未知的ycf基因簇上调尤为显著（超过三倍），这些基因多由核编码RNA聚合酶转录，无法用DG1水平升高解释，提示RDE通过多靶点层级调控网络控制质体基因表达。林可霉素处理下rde-1仍保持淡绿色并积累更多叶绿素，而诺氟拉松处理下两种基因型均严重白化，表明RDE功能特异性关联叶绿体基因表达调控。蛋白稳定性实验显示rde-1中RPL2降解速率反而快于野生型，排除了蛋白稳定性增强的可能性，确证了RDE缺失增强叶绿体基因表达容量的模型。
（2）RDE蛋白丰度受光负调控，RDE抑制子叶扩展。暗转光过程中RDE转录水平稳定但蛋白丰度逐渐下降，提示翻译后调控机制。rde突变体在光照6小时内即积累可见叶绿素，明显早于野生型；DG1与psbA表达亦提前积累。2–3日龄rde幼苗子叶面积显著大于野生型，栅栏组织细胞增大1.5倍而细胞数目不变，表明RDE特异性约束细胞扩展而非细胞分裂。暗生长条件下两基因型细胞参数无差异，证实RDE调控的细胞扩展严格依赖光照。
（3）RDE与DPA物理互作并拮抗E2FA–DPA模块。Y2H筛选确认RDE与DPA互作，与TSA1在植物细胞内不互作（BiFC验证）。RDE不与DPB、E2FA或E2FC互作。DPA的二聚化结构域（140–249氨基酸）对RDE结合必要且充分。竞争性pull-down实验显示RDE以剂量依赖方式破坏DPA与E2FA的结合，但不干扰DPA与E2FB的结合，表明RDE特异性靶向E2FA–DPA复合物。
（4）RDE通过调控DPA活性参与细胞周期调控。rde-1突变体中多数S期基因上调，dpa突变体则下调；rde dpa双突变体表达水平接近dpa单突变体，表明RDE对S期基因的调控依赖DPA。流式细胞术显示rde-1子叶中2C和4C核比例减少而高倍性核增加，表明核内再复制水平升高；dpa突变体则相反。dpa突变可完全抑制rde-1中五分支和六分支毛状体的形成。dpa单突变体细胞数目与大小无显著变化（可能因DPB功能补偿），但dpa突变抑制了rde-1的细胞增大与子叶扩展表型。值得注意的是，rde dpa双突变体倍性仍略高于dpa单突变体，且rde突变体中DPB表达升高，提示RDE还通过间接机制调控DPB丰度，但DPA仍是子叶发育中RDE的主要下游效应因子。
（5）RDE与DPA共享靶基因。rde-1与e2fa-dpa-oe的转录组比较显示rde-1差异表达基因中64%与e2fa-dpa-oe重叠。ChIP-seq鉴定出5912个RDE结合峰（关联4856个基因）和6461个DPA结合峰（关联5260个基因），其中2172个峰（关联1686个基因）为共享靶标。GO富集分析揭示共享靶基因主要参与DNA复制与代谢（包括MCM、CDT1A、PCNA1等S期基因）以及核酸结合（包含DG1等胚胎致死基因）。在共享靶标中，除DG1外还发现三个编码叶绿体RNA结合蛋白的EMB基因（EMB975、EMB2750/PPR2等）。共享靶基因的ChIP-seq结合峰重叠或紧密相邻，峰区内均检测到预测的E2F–DP结合基序。
（6）RDE弯曲DNA并抑制E2FA–DPA转录活性。EMSA实验显示重组RDE蛋白可直接结合DG1启动子P1片段，形成两个特异性的RDE–DNA复合物。T4连接酶介导的环化实验证实RDE具有诱导并稳定DNA弯曲的能力。双荧光素酶报告实验表明E2FA–DPA显著激活EMB与S期基因启动子活性，该激活被RDE共表达显著抑制；RDE单独表达亦降低基础报告活性。在rde-1原生质体中E2FA–DPA的转录激活程度高于野生型。这些结果确立RDE作为E2FA–DPA转录活性的抑制因子，其机制可能通过DNA弯曲促进DNA环化，将DPA隔离在稳定核蛋白复合物中，阻止DPA–E2FA异源二聚体形成（图8模型）。
四、研究结论与科学意义
本研究鉴定了一个进化上保守的DNA架构因子RDE，其通过物理互作DPA并在靶启动子处诱导DNA弯曲，将DPA螯合于稳定的核蛋白复合物中，抑制DPA–E2FA异源二聚体形成，从而抑制S期基因与编码叶绿体RNA结合蛋白的EMB基因的转录。光照触发RDE降解，解除抑制，使黄化质体向叶绿体分化与G1–S期转换同步进行，驱动核内再复制依赖的细胞扩展，最终实现子叶变绿与生长。该RDE–E2FA–DPA模块从单细胞藻类到被子植物均保守存在，代表了光合真核生物适应中偶联细胞器生物发生与增殖生长的古老同步机制。
本研究具有三重科学价值。其一，揭示了一条调控叶绿体发育的全新通路：不同于HY5–GLK等以叶绿素合成或光合机构为核心的光响应调控系统，RDE–DPA模块作为细胞周期组分直接参与叶绿体生物发生调控，将细胞周期进程与细胞器发育在分子层面耦合。其二，发现了一种新型转录抑制机制：RDE虽无经典DNA结合域，却具有DNA弯曲活性，可能通过促进DNA环化隔离DPA，为细胞周期转录调控提供了DNA架构因子参与的新范式。其三，阐明了光信号调控核内再复制组织特异性的分子节点：光通过调控RDE蛋白稳定性门控DPA可用性，补充了此前基于E2FC–E2FB拮抗平衡的认识，为重建光调控的发育网络提供了机制蓝图。
五、研究亮点
本研究的突出创新体现在以下方面。第一，首次将叶绿体发育调控与细胞周期核心机制在分子层面直接关联，发现E2F–DP模块的新功能。第二，鉴定并功能表征了RDE这一绿色植物特有的DNA架构因子，揭示其通过DNA弯曲而非经典序列特异性结合实现转录抑制的新机制。第三，利用多层次的遗传学与生化证据（抑制子筛选、竞争性pull-down、ChIP-seq、DNA环化实验、原生质体转录活性检测等）构建了从蛋白互作到DNA拓扑结构再到生理表型的完整证据链。第四，通过系统发育分析揭示RDE在绿色植物谱系中的保守性与进化起源，提示该机制可能在内共生早期即已确立，对理解光合真核生物的进化适应具有重要意义。