该研究由Qing Guo、Shihao Li、Xinjia Lv、Jianhai Xiang、Rivka Manor、Amir Sagi和Fuhua Li共同完成，分别来自中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室、青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生物学与生物技术实验室、中国科学院海洋大科学中心、中国科学院大学以及以色列本-古里安大学生命科学系。研究成果于2019年12月20日发表在期刊《Frontiers in Physiology》上，文章标题为《Sex-Biased CHHs and Their Putative Receptor Regulate the Expression of IAG Gene in the Shrimp Litopenaeus vannamei》。

学术背景
该研究聚焦于甲壳动物的性别决定与分化机制，特别是“眼柄-促雄性腺-睾丸”内分泌轴（”eyestalk-ag-testis” endocrine axis）的调控网络。胰岛素样促雄性腺激素（IAG, insulin-like androgenic gland hormone）是促雄性腺分泌的核心激素，但其上游调控因子尚未明确。此前研究发现，眼柄X器官-窦腺复合体（XO-SG）分泌的甲壳动物高血糖激素家族（CHH家族）可能参与这一过程，但具体分子机制尤其是受体通路缺乏证据。本研究以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为模型，旨在揭示CHH亚家族I成员（LvCHH1和LvCHH2）及其受体鸟苷酸环化酶（LvGC）如何通过调控IAG基因表达参与雄性性别发育。

研究流程
1. 基因鉴定与序列分析
- 通过转录组数据库筛选获得LvCHH1、LvCHH2和LvGC的cDNA序列，克隆其开放阅读框（ORF）。
- 使用SMART工具预测蛋白结构域，ClustalW进行多序列比对，MEGA7构建系统发育树（bootstrap=1000次）。
- 结果显示：LvCHH1（432 bp编码143 aa）和LvCHH2（375 bp编码124 aa）均具有CHH亚家族I特征（含CPRP结构域、KR加工信号和GK酰胺化信号）；LvGC（4551 bp编码1516 aa）为膜结合型鸟苷酸环化酶，含配体结合域、跨膜域和催化域。

1. 表达模式分析

   • 组织分布：RT-PCR和qPCR检测14种组织（包括眼柄、性腺、神经组织等），发现LvCHH1/2在雄性眼柄中表达显著高于雌性，而LvCHH2在卵巢中高表达；LvGC在雄性眼柄和性腺中表达更高。
     
   • 原位杂交：眼柄切片显示LvCHH1/2转录本定位于X器官（MTXO、MEXO）和窦腺（SG）的分泌细胞。

2. 功能验证实验

   • 基因沉默（RNAi）：设计dsRNA（LvCHH1: 577 bp；LvCHH2: 439 bp；LvGC: 577 bp），优化剂量后注射（LvCHH1: 2 μg；LvCHH2: 4 μg；LvGC: 2 μg）。48小时后：
     
     • 沉默LvCHH1使LvIAG表达上调147.6%，LvGC下调24.2%；
       
     • 沉默LvCHH2使LvIAG上调260%，LvGC下调30.3%；
       
     • 沉默LvGC使LvIAG上调78%。
       
   • 重组蛋白注射：大肠杆菌表达系统制备rCHH1/rCHH2（分子量30 kDa/25 kDa），梯度尿素复性后注射（5 μg/只）。24小时后LvIAG表达下降94%（rCHH1）和92%（rCHH2），同时LvGC在眼柄和头胸甲中表达上调40%-60%。
     
   • 单侧眼柄切除：术后7天LvIAG表达升高180%，证实眼柄的抑制作用。

3. 受体互作验证

   • 酵母双杂交：将LvCHH1/2成熟肽与LvGC胞外域共转化酵母Y2H Gold，SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal筛选显示阳性互作（菌落显蓝色）。
     
   • 亚细胞定位：构建pEGFP-LvGC质粒转染293T细胞，荧光信号定位于细胞膜，证实其膜结合特性。

主要结果
1. LvCHH1和LvCHH2属于CHH亚家族I，具有性别偏向性表达模式，尤其在雄性眼柄中高表达。
2. RNAi和重组蛋白实验证明LvCHH1/2通过负调控LvIAG表达抑制雄性性发育，而LvGC作为其受体介导这一过程。
3. 酵母双杂交和亚细胞定位证实LvCHH1/2与LvGC的直接互作，且LvGC自身沉默同样导致LvIAG上调，形成“CHH-GC-IAG”调控轴。

结论与价值
该研究首次在凡纳滨对虾中揭示了CHH亚家族I成员通过膜受体LvGC调控IAG表达的分子机制，完善了“眼柄-促雄性腺-睾丸”内分泌轴的上游信号通路。科学价值在于：
1. 为甲壳动物性别决定理论提供了受体水平的分子证据；
2. 提出了CHH家族成员跨亚家族功能的新视角（传统认为亚家族II参与性腺抑制）；
3. 应用潜力包括通过靶向调控CHH-GC-IAG通路实现经济甲壳动物的性别控制育种。

研究亮点
1. 创新性发现CHH亚家族I的性别调控功能，突破其仅参与糖代谢的传统认知；
2. 首次鉴定LvGC为CHH的膜受体，并通过多方法（酵母双杂交、亚细胞定位、功能丧失/获得实验）验证其作用；
3. 实验设计系统性强，涵盖基因沉默、蛋白干预、组织切除等多层次证据链。

其他价值
研究中开发的重组蛋白复性方法（梯度尿素透析）和眼柄石蜡切片原位杂交技术可为甲壳动物神经内分泌研究提供方法学参考。数据已提交NCBI（登录号：MK732901-3），支持后续比较基因组学研究。