汉坦病毒核衣壳高清结构揭示其组装机制与潜在抗病毒靶点

Benoît Arragain， Juan Reguera， Ambroise Desfosses， Irina Gutsche， Guy Schoehn， Hélène Malet * 通讯作者：guy.schoehn@ibs.fr (gs); helene.malet@ibs.fr (hm) 发表期刊与时间：elife, 2019年1月14日在线发表。

一、 学术背景

本研究的核心科学领域是结构病毒学与分子生物物理学。研究聚焦于汉坦病毒（Hantaan virus, HTNV），这是一种属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）汉坦病毒科（Hantaviridae）的负链分节段RNA病毒（segmented negative-strand RNA viruses, sNSV）。汉坦病毒可引发出血热伴肾综合征等严重人类疾病，病死率高达40%，目前尚无有效的治疗药物或疫苗，因此是重要的公共卫生威胁。

在所有负链RNA病毒（NSV）的生命周期中，病毒基因组RNA均被大量核蛋白（nucleoprotein， NP）包裹，形成螺旋状的核衣壳（nucleocapsid， NC）。核衣壳是病毒复制与转录所必需的关键模板。然而，绝大多数NSV的完整核衣壳由于其固有的高度柔性，难以利用结构生物学方法进行高分辨率的结构解析。此前，对于汉坦病毒核蛋白，已有其单体或环状低聚体的晶体结构报道，但它们未能揭示其在病毒中实际存在的、与RNA结合的螺旋组装体的具体结构。汉坦病毒的核衣壳在病毒颗粒内和感染细胞中呈现出相对刚性的螺旋形态，这为获得其高分辨率结构提供了独特的可能性。

本研究旨在利用冷冻电镜（cryo-electron microscopy， cryo-EM）技术，解析重组表达的全长汉坦病毒核衣壳（HTNV-NC）与RNA结合的高分辨率三维结构。主要目标包括：1. 揭示HTNV-NC的精确原子结构；2. 阐明核蛋白单体之间通过何种机制进行螺旋状多聚化组装；3. 可视化病毒基因组RNA在核衣壳中的结合位置与模式；4. 基于结构信息，理解核衣壳如何在保持结构完整性的同时，允许病毒聚合酶（polymerase）接触RNA以进行复制和转录；5. 为未来基于结构的抗病毒药物设计提供关键靶点信息。

二、 详细工作流程

本研究是一项结合分子克隆、蛋白质表达纯化、生物化学分析和冷冻电镜三维重构的系统性结构生物学研究。其详细工作流程可分为以下几个关键步骤：

1. 克隆、表达与纯化重组HTNV核蛋白（NP）：

   • 研究材料与构建： 研究团队合成了经过密码子优化的汉坦病毒（NCBI登录号NC_005218）NP全基因序列，并在其N端添加了组氨酸标签和TEV蛋白酶切割位点。该基因被克隆到pFastBac1杆状病毒表达载体中。
   • 表达系统： 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统（Bac-to-Bac方法）在SF21昆虫细胞中大规模表达带His标签的重组HTNV-NP。
   • 纯化流程： 细胞裂解后，上清液首先通过镍柱亲和层析纯化。洗脱的蛋白随后用TEV蛋白酶切割以去除His标签，并进行透析。第二步再次通过镍柱去除被切下的标签、未切割的蛋白以及蛋白酶。纯化过程中，通过超速离心浓缩蛋白样品。纯化产物的260/280 nm吸光度比值约为1.0，表明在表达过程中，重组NP结合了昆虫细胞的RNA，形成了核糖核蛋白复合物（即核衣壳，NC）。研究共进行了三个生物学独立批次的大规模表达和十五个批次的纯化，结果具有可重复性。

2. 冷冻电镜样品制备与数据收集：

   • 样品制备： 将纯化的重组HTNV-NC样品应用至经辉光放电处理的Quantifoil碳支持膜网格上，使用Vitrobot Mark IV进行快速冷冻，将其包埋在薄层玻璃态冰中。
   • 数据采集： 研究收集了两个独立的数据集。第一个数据集在FEI Polara F30显微镜上收集，获得了3.8 Å分辨率的初步结构。本文报道的主要结果基于第二个、分辨率更高的数据集，该数据集在配备Gatan K2直接电子探测器和能量滤波器的FEI Titan Krios显微镜上采集。采用自动数据采集软件（EPU），共收集了4328张电影图像，累计电子剂量为40 e⁻/Ų。最终用于处理的数据经过运动校正和漂移补偿。

3. 图像处理与三维重构：

   • 软件与算法： 整个图像处理流程主要依赖于当时先进的开源软件。运动校正使用MotionCor2， 衬度传递函数（CTF）估计使用GCTF， 后续的二维分类、三维重建及优化均在RELION（2.1及3.0版本）软件中进行。
   • 数据处理流程： a. 颗粒挑选与提取： 从显微图像中手动挑选出笔直的HTNV-NC长丝，并沿螺旋轴以38 Å的间隔切割成重叠的二维子图（box），共提取出168,709个片段。 b. 二维分类与对称性确定： 对提取的片段进行二维分类，筛选出质量最佳的类别用于后续分析。对最佳二维类别的功率谱进行平均，利用傅里叶-贝塞尔指数法（Fourier-Bessel indexing）初步确定螺旋对称性参数。分析发现，HTNV-NC为左手螺旋，螺距（pitch）约为68.03 Å，每圈包含约3.6个NP亚基。 c. 三维螺旋重构： 使用经过筛选的111,248个高质量片段，以一个直径为130 Å的无特征圆柱体作为初始模型，进行三维螺旋重构。通过迭代优化，最终精修确定的螺旋参数为：每个亚基的轴向上升（rise）为18.87 Å，螺旋扭转角（twist）为-99.95°。 d. 分辨率与局部分辨率评估： 最终重构的三维密度图经过后处理（使用-103 Ų的B因子进行锐化），根据傅里叶壳层相关系数（FSC）0.143的黄金标准，其全局分辨率为3.3 Å。通过局部分辨率评估，确认了结构核心区域具有更高的信噪比。

4. 原子模型搭建、优化与验证：

   • 初始模型拟合： 将已发表的HTNV-NP单体晶体结构（包含残基113-429， PDB代码：5FSG）作为两个刚性体（残基113-398和399-429）拟合到3.3 Å分辨率的冷冻电镜密度图中。
   • 手动搭建与修正： 使用Coot软件，根据密度图手动搭建了晶体结构中缺失的部分，包括：N端臂（残基80-112）、核心域的两个环区（残基146-155和349-360）以及新观察到的β-发夹结构（残基152-181，特别是残基160-172区域）。同时，在密度图中清晰可见的三个部分占据的核苷酸也被手动搭建。
   • 模型优化与精修： 将搭建好的单体模型根据螺旋对称性扩展为包含7个亚基的长丝模型。随后，使用Phenix软件，在立体化学限制和非晶体学对称（NCS）限制下，对整个纤维模型进行迭代式的全原子精修，使模型与密度图达到最佳匹配，并确保良好的几何参数。
   • RNA路径建模： 由于密度图中仅显示了三个部分占据的核苷酸，为了推测全长RNA的结合路径，研究团队基于拉克罗丝病毒（La Crosse virus， LACV）NP中已确定的RNA结合模式（Reguera et al.， 2013），将LACV的RNA片段与HTNV-NC结构进行了对接和建模。他们使用HADDOCK软件进行柔性对接，在保持HTNV-NP与已观察到的三个核苷酸（HTNV-nts）相互作用的前提下，模拟了连接这些核苷酸的更长RNA片段（取自LACV-NP结构）的可能位置，从而预测每个HTNV-NP约可结合8-10个核苷酸。

5. 生物化学验证与稳定性分析：

   • 有限蛋白酶解： 使用胰蛋白酶对重组HTNV-NC进行有限酶切，通过SDS-PAGE和N端测序，鉴定出一个稳定的截短体（NP74-429），该截短体仍能形成刚性螺旋，证明N端1-73残基对于螺旋结构的稳定并非必需，其可能在体内具有其他功能（如与聚合酶相互作用）。
   • 稳定性测试： 通过实验验证了重组HTNV-NC在广泛的盐浓度、pH和温度条件下均能保持稳定，这与其结构中观察到的广泛且多重的亚基间相互作用相一致。

三、 主要研究结果

1. HTNV-NC的整体结构与域组成：

   • 冷冻电镜重构的HTNV-NC是一个左手螺旋结构，螺距为68.03 Å，每圈包含3.6个NP亚基。这一参数与病毒颗粒内观察到的螺旋形态一致，支持了该重组结构的生物学相关性。
   • 尽管表达了全长NP，但在最终密度图中，N端第1-79位残基不可见，表明该区域不遵循螺旋对称性，是一个柔性区域。有限蛋白酶解实验证实，缺失N端1-73的NP74-429截短体仍能形成刚性螺旋。
   • 每个NP亚基（残基80-429）的结构可划分为三个主要部分：（i）核心域（NP_core， 残基117-398）：包含两个叶瓣，围成一个带正电荷的沟槽，该沟槽用于结合RNA。（ii）N端臂（NtArm， 残基80-112） 和（iii）C端臂（CtArm， 残基399-429）：这两个臂通过柔性铰链区与核心域相连。值得注意的是，与单体晶体结构相比，在螺旋组装体中，CtArm发生了约130.4°的大幅度旋转，导致同一个亚基的NtArm和CtArm相互“拥抱”，形成独特的臂内相互作用。

2. 核蛋白螺旋多聚化的分子机制：

   • HTNV-NC的刚性源于每个NP亚基与周围六个相邻亚基之间形成的多重、广泛的相互作用（每个界面埋藏面积达2704 Ų）。
   • 螺旋组装的关键驱动力是相邻亚基之间的结构域交换（sub-domain exchange）： a. N端臂交换：亚基i（NP_i）的NtArm伸入并紧密结合到前一个亚基（NP_i-1）的核心域中。具体而言，NP_i的NtArm残基101-103与NP_i-1核心域新发现的β-发夹（残基152-181）中的两个β-链（残基155-160和177-181）共同形成一个三链β-折叠片。此前的研究已证实，破坏此相互作用的突变（如L102A， V104A）会显著破坏NC的稳定性。 b. C端臂交换：NP_i的CtArm（一个两亲性螺旋）插入到后一个亚基（NP_i+1）核心域的一个疏水口袋中。这与早期的酵母双杂交实验预测结果相符。 c. β-发夹的“夹扣”作用：NP_i核心域的β-发夹（残基152-181）的尖端（残基162-175）像夹子一样，跨过两个亚基（NP_i+2和NP_i+3），与它们的C端区域相互作用，进一步加固了整个螺旋组装体，解释了其独特的刚性。这种“夹扣”作用是HTNV-NC区别于其他更柔性核衣壳（如流感病毒NC）的一个关键特征。

3. RNA的结合模式：

   • 尽管重组NP是在无病毒RNA的情况下表达的，但纯化产物中结合了宿主细胞的RNA。在3.3 Å分辨率的密度图中，可以清晰地观察到每个NP亚基结合了三个部分占据的核苷酸。这三个核苷酸位于核心域的正电荷沟槽内部。
   • 结构分析揭示了关键的RNA结合残基：R197， R314， R368， R146和K153通过盐桥与RNA的磷酸基团相互作用；F361则稳定了核苷酸碱基之间的堆叠网络。这些残基的突变被已知的辛诺柏病毒（Sin Nombre virus）NP的RNA结合实验所支持。
   • 连续的带正电荷沟槽以及额外低占据密度的核苷酸迹象表明，该结构能够容纳更长的病毒基因组RNA。基于LACV-NP的RNA路径建模进一步支持了这一观点，预测每个HTNV-NP可以结合约8-10个核苷酸。

4. 与同源病毒核蛋白结构的比较：

   • HTNV与LACV（同为布尼亚病毒目）的NP核心域具有相似的折叠。将LACV-NP单体中已确定的RNA结合位点叠加到HTNV-NC上，发现HTNV-NC中观察到的三个核苷酸的构象与LACV-NP中的第5、6、7个核苷酸相似，且关键结合残基（如R197， R367， F361）在LACV中是保守的（R94， R183， Y177）。这表明，尽管病毒不同，但其核蛋白封装RNA的基本机制是保守的。
   • 然而，HTNV的N端臂更长，且连接着一个未解析的柔性N端区域（残基1-73），这可能与病毒特异的聚合酶招募机制有关。

四、 研究结论与意义

本研究成功解析了汉坦病毒全长RNA结合螺旋核衣壳（HTNV-NC）的3.3 Å高分辨率冷冻电镜结构，这是首次对负链RNA病毒中一个完整的、与基因组RNA结合的螺旋核衣壳进行近原子级精度的结构阐释。

科学价值： 1. 揭示了核衣壳组装的详细机制： 结构清晰地展示了HTNV-NP通过N端臂和C端臂与相邻亚基核心域进行交换，并借助一个独特的β-发夹“夹扣”作用，形成稳定而刚性的螺旋结构。这整合并验证了过去多年生化和遗传学研究的零散发现，提供了一个完整、精确的分子图景。 2. 阐明了RNA的结合与封装模式： 研究首次直接观察到了RNA在HTNV核衣壳中的结合位置和具体相互作用，确认了带正电荷沟槽是基因组RNA的“巢穴”。这解释了核蛋白如何非特异性地结合并保护病毒RNA。 3. 提出了复制/转录的工作模型： 基于结构，研究者提出了一个关于病毒聚合酶如何在不完全解离核衣壳的情况下接触并复制/转录RNA的假设模型。他们推测，病毒聚合酶可能通过与NP的柔性N端区域（残基1-73）结合，局部性地破坏NP_i的NtArm与NP_i-1核心域之间的关键相互作用，从而在螺旋上打开一个临时性的“窗口”，允许聚合酶接触少数几个核苷酸。由于CtArm和其他相互作用（如β-发夹的夹扣）仍然存在，这种局部破坏不会导致整个核衣壳的解体。这一模型为理解负链RNA病毒这一核心生命过程提供了重要的结构基础。

应用价值： 1. 为抗病毒药物设计提供了新靶点： 结构清晰地指出了驱动核蛋白多聚化（如NtArm/核心域界面、CtArm疏水口袋、β-发夹尖端）和RNA结合（如R146， R197， R314等）的关键区域。这些区域是开发小分子或多肽类药物的理想靶点，通过干扰这些相互作用可以破坏核衣壳的稳定性或阻止RNA封装，从而抑制病毒复制。 2. 为诊断与疫苗研发提供结构依据： 结构分析将已知的抗原表位定位在核衣壳表面的可变区域（参见图1-补充图3），这为开发更精准的血清学诊断方法以及理解抗体中和机制提供了结构框架。

五、 研究亮点

1. 高分辨率结构突破： 克服了负链RNA病毒完整核衣壳固有的柔性问题，首次解析了汉坦病毒全长、RNA结合的螺旋核衣壳近原子分辨率（3.3 Å）结构，是该领域的重大进展。
2. 揭示了独特的刚性化机制： 发现了之前未报道的β-发夹“夹扣”作用，这一结构特征解释了为何HTNV-NC比其他许多NSV的核衣壳更为刚性，为理解核衣壳结构的多样性提供了新视角。
3. 整合结构与功能： 研究不仅呈现了静态结构，还将结构观察与已有的生化、遗传数据（如突变体分析、酵母双杂交、RNA结合实验）紧密结合，相互印证，使结论非常坚实。
4. 提出创新的工作机制模型： 基于结构特征，提出了一个关于聚合酶如何在保持核衣壳大体完整的前提下进行RNA合成的合理模型，推动了该领域对病毒复制机制的理解。
5. 强大的方法学： 综合利用了先进的冷冻电镜技术、复杂的螺旋重构算法、巧妙的生物化学验证（如有限蛋白酶解）以及基于同源结构的计算建模，展示了现代结构生物学解决复杂生物大分子复合体问题的强大能力。

六、 其他有价值的内容

本研究还提供了详细的方法学描述，包括蛋白质表达纯化优化流程、冷冻电镜数据收集参数、图像处理中螺旋对称性确定的详细步骤（如傅里叶-贝塞尔指数法的应用），以及原子模型搭建和精修的具体策略。这些内容为同行重复实验或研究类似螺旋结构提供了宝贵的参考。此外，文章中提及的两个独立数据集（分别获得3.8 Å和3.3 Å结构）以及大量的生物学重复，确保了研究结果的可靠性和可重复性。所有原子坐标和冷冻电镜密度图均已公开存入PDB（6I2N）和EMDB（EMD-0333）数据库，体现了科学研究的开放性和可验证性。