本研究由武汉纺织大学纺织纤维及制品教育部重点实验室的唐天志、甘金平、曹展瑞、程盼、程芹、刘轲、王栋等学者，联合武汉微创科技有限公司梅涛、东华大学材料科学与工程学院朱利平及百威亚太周锋共同完成。通讯作者为程芹与刘轲。该成果于2024年4月16日发表于 Polymers 期刊，题为“Ethylene vinyl alcohol copolymer nanofibrous cation exchange chromatographic membranes with a gradient porous structure for lysozyme separation”。

研究背景方面，溶菌酶是一种广泛存在于动植物及微生物中的抗菌剂，能够破坏细菌细胞壁肽聚糖层中的1,4-β糖苷键，在食品、生物制药和化工领域应用广泛。蛋清是溶菌酶提取的主要原料，但其中溶菌酶含量较低、杂质去除困难，因此快速且低成本的溶菌酶分离方法一直是研究热点。传统柱色谱法在蛋白质分离中存在吸附材料与蛋白质作用弱、流速慢、比表面积小等不足。膜色谱技术因其条件温和、分离效率高、操作简单和占地小等优势受到关注。其中，以磺酸基为配体的强阳离子交换膜能与溶菌酶产生强静电作用，从而缩短蛋白在膜孔道中的停留时间，实现快速分离。纳米纤维膜因孔径可调、比表面积大、易于功能化而成为高性能色谱材料的理想候选。该研究旨在开发一种具有梯度多孔结构的乙烯-乙烯醇共聚物（EVOH）纳米纤维阳离子交换色谱膜，用于高效吸附分离溶菌酶，并系统探究孔隙结构对吸附性能的影响机制。

研究流程主要包括三个环节。首先，通过熔融挤出相分离法，以不同挤出速度制备了平均直径分别为约264.5 nm和762.6 nm的EVOH纳米纤维，并采用逐层湿法铺网工艺分别构建均质多孔膜和梯度多孔膜。均质膜命名为N-x（x为纤维直径），其中N-200和N-750分别代表细纤维和粗纤维膜。梯度膜则先以细纤维铺制底层，再在其上涂覆粗纤维层，命名为NS-200-750(n)，其中n代表上层粗纤维涂覆密度（1、2、4 g/m²）。第二步为紫外光辅助接枝改性：以二苯甲酮（BP）为光引发剂，2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸（AMPS）为改性单体，在氮气保护下将膜浸渍于BP/AMPS的DMF溶液后紫外辐照，使纳米纤维表面引入磺酸基团。通过优化反应时间、BP浓度和AMPS浓度，确定最佳接枝条件为反应20分钟、BP浓度2.5%、AMPS浓度20%。第三步对改性膜进行系统的理化表征与吸附性能测试。表征手段包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）、扫描电子显微镜（SEM）、固体Zeta电位、水接触角、毛细管流动孔径仪、气体比重计及比表面积分析仪等。吸附性能测试分为静态和动态两类：静态吸附在pH=5的磷酸盐缓冲液中进行，使用2 g/L溶菌酶溶液，测定膜在180分钟内的吸附量；动态吸附则利用注射泵和自制色谱柱，在1.5 mm/min流速下获取穿透曲线。同时进行了五次吸附-脱附循环以评价膜的可重复使用性，脱附采用含1 M NaCl的磷酸盐缓冲液。

主要结果显示，FTIR谱图中出现了1716 cm⁻¹（-C=O伸缩振动）、1638 cm⁻¹和1546 cm⁻¹（-C=O-NH-伸缩振动）、1042 cm⁻¹（磺酸基伸缩振动）及700 cm⁻¹（苯环C-H弯曲振动）等新峰，XPS谱图中也检测到磺酸基的C-S和S=O特征峰，证实AMPS成功接枝到膜表面。改性后膜的亲水性提高，NS-200和NS-750的水接触角均小于未改性膜。在孔径和孔隙率方面，NS-750的平均孔径从763.5 nm降至666.1 nm，孔隙率降至81.21%；NS-200的平均孔径降至243.2 nm，孔隙率降至65.91%。梯度膜NS-200-750的跨膜孔径为217.1 nm，孔隙率和比表面积介于NS-200和NS-750之间，但其拉伸应变较均质膜提高24%。静态吸附实验中，未改性膜对溶菌酶几乎无吸附，NS-200-750在180分钟达到饱和，静态饱和吸附容量为335 mg/g，显著高于NS-750（164.3 mg/g）和NS-200（175.2 mg/g）。吸附动力学符合准二级模型，等温吸附符合Langmuir模型。pH对吸附容量影响显著，pH=5时达到最大值335 mg/g，过低pH抑制磺酸基解离，过高pH降低溶菌酶表面正电荷数量。五次循环后，NS-200-750仍保持高吸附容量，脱附效率超过90%。动态吸附测试中，NS-200-750色谱柱的穿透体积为40 mL，动态饱和吸附容量为216.3 mg/g，高于NS-750柱（11 mL）、NS-200柱（18 mL）和商品化色谱柱（26 mL），且五次动态循环后性能稳定。水通量测试显示，NS-200-750的水通量为4455 L h⁻¹ m⁻²，比NS-200高26.7%。

研究结论指出，尽管NS-200-750的孔隙率、平均孔径和比表面积并非最优，但其静态和动态吸附性能均显著优于均质多孔膜，证明梯度多孔结构是决定吸附性能的关键因素。该梯度结构由上层粗纤维形成的大孔和下层细纤维形成的小孔组成，大孔外层增强了对流传质，小孔内层避免了蛋白吸附后对后续扩散的堵塞，从而实现了更高的蛋白捕获与释放速率。这一发现表明，从跨膜孔隙结构角度设计综合分离性能优异的膜材料具有重要指导意义，为下一代先进色谱膜的开发提供了新思路。

本研究的亮点在于：首次将梯度多孔结构引入EVOH纳米纤维阳离子交换色谱膜，并通过逐层湿法铺网与紫外接枝相结合的低成本方法实现制备；系统证明了孔隙结构而非单一参数（如比表面积或孔隙率）对蛋白吸附性能的主导作用；在保证高吸附容量的同时实现了优异的循环使用性能和动态分离效果，具有实际应用潜力。此外，研究中自制的注射泵动态吸附测试装置和优化的接枝条件也为相关膜色谱材料研究提供了方法参考。