本研究的主要作者包括Tong Chang、Ping Wang、Fenglu Han、Xiaolong Liang、Xianming Xiao、Hu Chen、Chang Xu和Erchao Li，他们分别来自海南大学和华东师范大学。该研究于2024年2月发表在期刊《Aquaculture》上，DOI为10.1016/j.aquaculture.2024.740669。

学术背景

本研究属于水产养殖领域，重点关注南美白对虾（Litopenaeus vannamei）雄性个体的性腺发育过程及其调控机制。南美白对虾是全球水产养殖业中经济价值极高的物种，其繁殖生物学研究对推动育种行业的发展至关重要。然而，过去的研究主要集中在雌性对虾的繁殖生物学上，而雄性对虾的性腺发育过程及其分子调控机制尚未得到充分研究。因此，本研究旨在通过形态学、组织学、生化和分子分析，阐明南美白对虾雄性个体性腺发育的阶段性特征及其调控机制，为培育高质量的雄性亲虾和幼苗提供科学依据。

研究流程

本研究分为多个步骤，详细流程如下：

1. 实验动物与管理
   研究选用了南美白对虾的后期幼体，将其在室内水池中驯养至70天龄，观察到雄性个体的生殖孔形成后，将其转移到单独的养殖池中继续培养。在整个养殖期间，对虾被饲喂商业饲料（蛋白质含量42%，脂质含量5%），每天四次。根据实验需求，对虾被连续解剖以观察和记录性腺发育的动态变化。

2. 采样
   研究采用纵向研究设计，从性分化完成开始，每隔5-7天随机采集9只不同大小的雄性对虾，记录其体重和体长，并在高分辨率立体显微镜下观察雄性生殖孔、末端壶腹和交配器的外部变化。每次采样时，随机选择3只雄性个体进行解剖，量化肝体指数（HSI）和性腺指数（GSI），并观察睾丸、输精管和精囊的形态、颜色、大小和充盈状态。

3. 精子计数分析
   在每个发育阶段，选择3只雄性对虾，使用血细胞计数仪测量单侧精囊中的总精子数和缺失棘状精子的数量。若无精囊，则使用单侧壶腹作为样本。精子或精囊在无钙海水中研磨以释放精子，并使用光学显微镜进行活体计数。

4. 组织学观察
   使用常规石蜡切片技术对睾丸和输精管进行组织学分析。睾丸和输精管组织在4%多聚甲醛中固定24小时，随后进行脱水、清洗、石蜡包埋和切片（5微米），最后进行苏木精-伊红（H&E）染色，并在显微镜下观察。

5. 酶活性和激素浓度测量
   通过ELISA试剂盒检测血清中的甲壳类高血糖激素（CHH）水平，并测量眼柄和睾丸组织中的CHH、鸟苷酸环化酶（GC）、睾酮（T）和细胞周期依赖性激酶（CDKs）的活性。

6. 基因表达检测
   使用实时荧光定量PCR技术检测眼柄和末端壶腹中与性腺发育相关的基因（CHH1、CHH2、GIH、MIH、IAG和ILP）的表达水平。RNA提取后，使用Trizol试剂进行反转录，并通过SYBR Green qPCR Master Mix进行定量分析。

7. 睾丸转录组分析
   在每个发育阶段，随机选择3只雄性对虾的睾丸组织进行转录组分析。RNA提取后，使用Illumina TruSeq™ RNA样品制备试剂盒进行文库制备，并在Illumina HiSeq X Ten/Novaseq 6000测序仪上进行测序。通过Hisat2将原始读数与参考基因组比对，并使用StringTie组装转录本。差异表达基因（DEGs）分析使用DESeq2进行，功能富集分析使用GO和KEGG进行。

主要结果

1. 性腺发育阶段及其特征
   研究将南美白对虾雄性个体的性腺发育过程分为四个阶段：

   • 阶段I（PL80）：性分化完成，性腺开始发育，睾丸透明，输精管纤细，壶腹呈透明水滴状，无精囊或精子。
     
   • 阶段II（PL143）：性腺开始快速发育，睾丸体积增大，输精管各段开始分化，壶腹出现轻微白色区域，但仍无精子。
     
   • 阶段III（PL165）：性腺接近成熟，睾丸呈乳白色，输精管各段明显分化，壶腹中出现未成熟的精囊，但精子数量较少且不成熟。
     
   • 阶段IV（PL188）：性腺完全成熟，睾丸呈乳白色，输精管增厚，壶腹中充满成熟的精子，雄性个体具备繁殖能力。

2. 激素浓度与酶活性
   血清中的CHH水平在性腺发育过程中呈下降趋势，尤其是在阶段III和IV。睾丸组织中的睾酮（T）水平在阶段III达到峰值，而细胞周期依赖性激酶（CDKs）的活性在阶段I最高，随后逐渐下降。

3. 基因表达分析
   CHH1、CHH2、GIH和MIH基因在眼柄中的表达水平在阶段I和IV较高，而在阶段II和III较低。IAG基因在阶段I和IV高表达，而ILP基因在阶段IV显著上调。

4. 转录组分析
   通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），研究发现了16个基因模块，其中蓝色模块与性腺指数（GSI）呈正相关，而青色模块与GSI呈负相关。蓝色模块中的基因主要富集在细胞周期、RNA代谢和减数分裂等通路，而青色模块中的基因则富集在溶酶体通路。

结论

本研究首次系统地描述了南美白对虾雄性个体性腺发育的四个阶段，并揭示了其分子调控机制。研究结果表明，眼柄中的CHH激素在性腺发育的不同阶段表现出不同程度的抑制作用，而IAG和ILP基因在性腺分化和精子成熟过程中发挥重要作用。这些发现为南美白对虾的雄性繁殖生物学提供了新的见解，并为人工调控性腺发育提供了潜在的分子靶点。

研究亮点

1. 性腺发育阶段的详细描述：研究首次将南美白对虾雄性个体的性腺发育过程分为四个阶段，并详细描述了每个阶段的形态学和组织学特征。
   
2. 分子调控机制的揭示：研究通过转录组分析，揭示了性腺发育过程中关键基因的表达变化及其调控通路。
   
3. 激素与基因表达的关联：研究明确了CHH、IAG和ILP等激素和基因在性腺发育中的调控作用，为后续研究提供了重要的理论基础。
   

其他有价值的内容

研究还发现，肝体指数（HSI）与性腺指数（GSI）呈负相关，表明肝胰腺与性腺发育之间存在物质转移，可能为性腺发育提供营养支持。这一发现为进一步研究雄性对虾的生殖营养需求提供了新的研究方向。