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植物内源基因的系统性沉默：两类21核苷酸人工小RNA的移动性研究

作者及机构
本研究由西班牙瓦伦西亚理工大学分子与细胞植物生物学研究所（Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas – Universitat Politècnica de València）的Adriana E. Cisneros、Ainhoa de la Torre-Montaña和Alberto Carbonell*（通讯作者）合作完成，研究成果于2022年3月11日在线发表于期刊*The Plant Journal*（2022年卷110期，1166–1181页）。

学术背景

研究领域与动机
本研究属于植物分子生物学与RNA干扰（RNA interference, RNAi）领域，聚焦于人工小RNA（artificial small RNAs, art-sRNAs）的设计与应用。art-sRNAs是一类通过计算设计的21核苷酸小RNA，能够以高效率和特异性沉默植物基因或病原RNA。传统方法依赖转基因植物实现全器官水平的基因沉默，但如何在特定组织中表达art-sRNAs并诱导远端组织的基因沉默尚未明确。本研究旨在探索两类art-sRNAs——人工微RNA（artificial microRNAs, amiRNAs）和合成反式作用小干扰RNA（synthetic trans-acting small interfering RNAs, syn-tasiRNAs）——能否在植物体内长距离移动并系统性沉默内源基因。

科学问题与目标
研究团队以烟草（*Nicotiana benthamiana*）的镁螯合酶亚基CHLI编码基因（*Nbsu*）为靶标，通过农杆菌浸润（agroinfiltration）在叶片中瞬时表达art-sRNAs，分析其诱导局部和系统性沉默的能力。核心问题包括：(1) art-sRNAs的移动性是否依赖其在叶柄附近的表达；(2) 系统性沉默是否需要靶基因mRNA产生次级sRNAs；(3) 移动的分子形式是前体还是成熟的sRNA双链。

研究流程与方法

实验设计与流程
研究分为以下关键步骤：

1. art-sRNAs设计与构建

   • 设计两类art-sRNAs（amiR-Nbsu-2和syn-tasiR-Nbsu-2），靶向*Nbsu*基因的独特位点，并通过生物信息学筛选避免脱靶效应。
     
   • 使用p-SAMS脚本优化设计，确保特异性。构建载体时，将amiRNA序列嵌入拟南芥*MIR390a*前体，syn-tasiRNA序列嵌入*TAS1c*前体，通过农杆菌转化烟草叶片。

2. 局部沉默的表型与分子验证

   • 表型分析：农杆菌浸润7天后，观察叶片漂白现象（*Nbsu*沉默的标志），并通过叶绿素含量定量验证。
     
   • 分子检测：Northern blot检测art-sRNAs积累水平，RT-qPCR量化Nbsu mRNA表达。结果显示，amiR-Nbsu-2积累量显著高于syn-tasiR-Nbsu-2，且两者均有效降低靶基因表达。

3. 系统性沉默的诱导与机制

   • 空间依赖性实验：仅在叶柄附近表达art-sRNAs时，上部未浸润叶片出现系统性沉默（表现为叶脉附近褪绿），而远端叶片区域无此现象。
     
   • 剂量效应分析：提高art-sRNAs表达量可增强系统性沉默强度，表明其移动性与表达水平正相关。
     
   • 次级sRNAs的作用：通过设计22核苷酸amiR-Nbsu-2（可触发次级sRNAs生成），发现系统性沉默不依赖次级sRNAs。在*dcl4i*和*rdr6i*突变体中，即使缺乏次级sRNAs通路，系统性沉默仍可发生。

4. 移动分子的鉴定

   • sRNA测序与RACE验证：高通量测序发现，系统性沉默组织中存在art-sRNAs双链（guide和star链），但未检测到其前体。50-RLM-RACE证实靶mRNA在远端组织中被精确切割。
     
   • 时间动态实验：移除浸润叶片后，amiRNAs在1–2天内即可触发系统性沉默，syn-tasiRNAs需1–3天，提示双链移动速度差异。

主要结果

1. art-sRNAs的移动性

   • 两类art-sRNAs（amiRNAs和syn-tasiRNAs）均能以21核苷酸双链形式通过胞间连丝和韧皮部长距离移动，沉默远端组织的靶基因。
     
   • 移动需满足两个条件：(1) 在叶柄邻近组织高表达；(2) 以成熟双链而非前体形式转运。

2. 次级sRNAs的非必要性

   • 22核苷酸amiR-Nbsu-2虽能触发次级sRNAs生成，但未能诱导系统性沉默，表明该过程不依赖“传递性（transitivity）”。

3. 应用潜力验证

   • 在抗病毒实验中，art-sRNAs通过局部表达实现全株保护，暗示其在作物抗病育种中的非转基因应用前景。

结论与意义

科学价值
本研究首次阐明植物内源基因的系统性沉默可由人工sRNAs介导，且不依赖次级sRNAs的放大效应。这一发现挑战了传统RNAi模型中次级sRNAs必需性的观点，为理解植物sRNA移动机制提供了新视角。

应用价值
- 农业生物技术：通过局部施用art-sRNAs（如叶面喷洒）实现全株基因沉默，规避转基因法规限制，适用于抗病作物开发。
- 基因功能研究：提供了一种非转基因的时空特异性基因敲降工具。

研究亮点

1. 方法创新：结合农杆菌浸润与高通量测序，建立了art-sRNAs移动性的动态追踪体系。
   
2. 理论突破：证明21核苷酸双链是系统性沉默的主要移动形式，修正了此前对sRNA前体作用的假设。
   
3. 跨学科应用：研究成果可延伸至病原体防控（如病毒干扰）和植物发育调控（如激素通路编辑）。

其他有价值内容

• 研究团队开发的p-SAMS设计脚本和优化载体（如attas1c-D2）已公开，可供后续研究直接使用。
  
• 实验数据通过SRA数据库共享（编号PRJNA811353），增强了结果的可重复性。