类型a
主要作者与研究机构及发表信息
该研究由Du Dejie、Li Zhaoju、Yuan Jun等共同完成，通讯作者为Ni Zhongfu和Xin Mingming。研究由中国农业大学作物杂种优势研究与利用教育部重点实验室、作物遗传改良国家重点实验室等机构主导完成。论文于2024年8月28日发表在《Science Advances》期刊上。
学术背景
本研究属于植物科学领域，具体聚焦于小麦（Triticum aestivum L.）叶片发育的分子机制。叶片是植物光合作用和呼吸作用的关键器官，其形态和大小直接影响作物产量。然而，关于小麦叶片发育的分子调控机制仍知之甚少。细胞分裂和细胞扩展是决定叶片宽度的重要因素，而细胞分裂素（cytokinin, CK）信号通路在调节叶片发育中起重要作用。此前的研究在水稻中已发现多个参与叶片宽度调控的基因，如OsNAL1（编码胰蛋白酶样丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶），但这些机制在小麦中的对应功能尚未明确。此外，Wall-Associated Kinases（WAKs）在植物细胞扩展和应激反应中具有重要作用，但其在小麦叶片发育中的具体功能尚不清楚。本研究旨在揭示调控小麦叶片宽度的分子机制，并探索相关基因的功能及其在农业育种中的潜在应用价值。
研究流程
本研究包含以下主要步骤：
突变体筛选与基因定位
研究团队从冬小麦品种Jinmai47的EMS诱变群体中筛选出窄叶突变体NL1。通过图位克隆策略，结合F2代分离群体（NL1×Bainong207），将候选基因定位到1A染色体短臂上的156-kb区间内。进一步测序分析发现，NL1突变体中TaWAK2-A基因的第1577位核苷酸发生了C至T的单碱基变异，导致第525位氨基酸从丙氨酸（Ala）突变为缬氨酸（Val）。
基因功能验证
为验证TaWAK2-A的功能，研究团队利用CRISPR-Cas9技术敲除TaWAK2-A基因，并通过农杆菌介导的转基因方法过表达该基因。实验结果表明，敲除TaWAK2-A导致叶片变窄，而过表达则使叶片变宽。此外，RT-qPCR分析显示，TaWAK2-A在不同组织中呈现显著的表达优势，尤其是在幼叶的维管束中高度积累。
蛋白质稳定性与相互作用研究
通过荧光标记和细胞降解实验，研究发现Ala525Val突变显著降低了TaWAK2-A蛋白的稳定性，但并未影响其激酶活性。进一步的Pull-down、Co-IP和双分子荧光互补实验（BiFC）证实，TaWAK2-A直接与胰蛋白酶样丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶TaNAL1相互作用，并通过磷酸化激活其功能。
下游信号通路解析
研究团队发现，磷酸化的TaNAL1通过降解锌指转录因子TaDST（Drought and Salt Tolerance）抑制其功能。TaDST作为叶片扩展的负调控因子，通过激活细胞分裂素氧化酶基因TaCKX9的表达，促进体内CK降解。RNA-seq分析显示，NL1突变体中TaCKX9和TaCKX11基因显著上调，而生物活性CK水平显著降低。外源施加细胞分裂素（6-BA）可部分恢复NL1突变体的窄叶表型。
数据处理与分析
数据分析包括RNA-seq差异表达基因分析、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定磷酸化位点、电泳迁移率变动分析（EMSA）验证转录因子结合位点等。所有实验均采用至少三次生物学重复以确保结果可靠性。
主要结果
1. TaWAK2-A的功能与稳定性
TaWAK2-A编码一种壁相关激酶（WAK），其Ala525Val突变显著降低了蛋白稳定性，但未影响激酶活性。这一突变导致NL1突变体中TaWAK2-A功能受损，进而引发窄叶表型。
TaWAK2-A-TaNAL1-TaDST信号级联
TaWAK2-A通过磷酸化激活TaNAL1，后者通过降解TaDST抑制其功能。TaDST作为负调控因子，通过激活TaCKX9/11基因表达降低体内CK水平，从而限制叶片扩展。
CK代谢与叶片发育的关系
NL1突变体中生物活性CK水平显著降低，而过表达TaCKX9基因可显著减少叶片宽度。外源施加6-BA可部分恢复NL1突变体的窄叶表型，表明CK代谢在叶片发育中起关键作用。
转录组分析揭示调控网络
RNA-seq分析显示，NL1突变体中差异表达基因显著富集于“细胞分裂素代谢过程”等GO条目，进一步支持了TaWAK2-A通过CK信号通路调控叶片发育的结论。
研究结论与意义
本研究揭示了TaWAK2-A-TaNAL1-TaDST-TaCKX9/11信号级联在调控小麦叶片宽度中的关键作用。研究不仅阐明了小麦叶片发育的分子机制，还为通过基因编辑或分子育种优化小麦株型提供了重要遗传资源。此外，研究发现TaWAK2-A可能作为细胞壁传感器响应环境变化，提示其在植物抗逆性研究中的潜在价值。
研究亮点
1. 首次报道了TaWAK2-A在小麦叶片发育中的功能及其通过CK信号通路调控叶片宽度的机制。
2. 发现Ala525Val突变显著降低TaWAK2-A蛋白稳定性，但不影响其激酶活性，为研究蛋白稳定性调控提供了新视角。
3. 揭示了TaWAK2-A-TaNAL1-TaDST-TaCKX9/11信号级联在CK代谢和叶片发育中的核心作用。
其他有价值内容
研究团队开发了一套高效的CRISPR-Cas9基因编辑系统，用于小麦功能基因组学研究。此外，研究中使用的LC-MS/MS和EMSA等技术为解析植物信号通路提供了可靠工具。