本研究由Syed Naeem Sajid、Weiwei Chen、Jon P. Cody、Lei He、Abraham R. Steinberger、Fang Wei、Zhengqing Xie、Baoming Tian、Daniel F. Voytas和Gongyao Shi等人合作完成，研究团队来自中国郑州大学农业科学学院（Henan International Joint Laboratory of Crop Gene Resources and Improvement）和美国明尼苏达大学（University of Minnesota）等多个机构。研究成果以《Agrobacterium-mediated root organogenesis and open treatment system (AgroRoots) for root functional genomics studies in cotton》为题，于2025年发表在期刊《Industrial Crops & Products》（卷236，文章编号122112）上。

学术背景

棉花作为全球重要的经济作物，其根系在水分吸收、抗逆性和植株健康中起关键作用。然而，由于缺乏高效的研究方法，针对根系功能的研究远落后于地上部分。传统方法如农杆菌介导的转化（Agrobacterium-mediated transformation）结合组织培养再生周期长、基因型依赖性强，且难以实现大规模根系功能分析。Agrobacterium rhizogenes诱导的毛状根转化（hairy root transformation）虽能快速获得转基因根系，但传统方法依赖无菌条件，且诱导的根系生理功能受限。因此，本研究开发了一种非无菌条件下、基于土壤栽培的棉花毛状根诱导系统——AgroRoots，旨在为棉花根系功能基因组学研究提供高效、可扩展的技术平台。

研究流程

1. 材料与方法

   • 植物材料：选用5个棉花品种（Zhongmian-24、R15、TM-1、Jinke Mian11、Hanza1692），种子经硫酸脱绒后播种于蛭石混合土壤中。
     
   • 农杆菌菌株筛选：测试6种A. rhizogenes菌株（K599、C58C1、AR-1193、MSU440、ARqual、A4）的转化效率，以携带Ruby报告基因（编码甜菜红素）的质粒pGY045为标记。
     
   • 转化参数优化：包括菌液浓度（OD600=0.3–1.3）、苗龄（6–10天）、湿度（开放环境vs.密封高湿环境）及真空渗透时间（0.5–4分钟）。
     
   • RI非依赖性系统构建：利用根形态发生调控基因rolABC（来自Ri质粒）通过A. tumefaciens（菌株EHA105和GV3101）诱导毛状根，避免Ri质粒的副作用。
     
   • CRISPR/Cas9基因编辑：设计靶向GhBASS5基因的sgRNA，通过K599递送编辑载体，验证毛状根中的突变效率。
     
   • 病毒介导的基因开关系统：利用烟草脆裂病毒（TRV）递送Cre重组酶，实现loxP位点介导的rolABC切除及下游Ruby基因激活。
     
   • 水培系统与根系分泌物分析：将转基因毛状根转移至霍格兰氏液（Hoagland solution）中培养，通过代谢组学分析根系分泌物成分。
     

2. 关键技术创新

   • 真空渗透法：优化后（0.7 MPa，2分钟）将转化效率提升至33.3%，显著高于传统注射法（26.6%）。
     
   • 水培富集系统：通过修剪野生型根系和抗生素筛选，实现转基因根系的长期培养（至开花期），并完成根系分泌物的动态收集。
     
   • RI非依赖性转化：通过rolABC基因替代Ri质粒，简化T-DNA整合事件，减少发育异常（如RI综合征）。
     

主要结果

1. 菌株与转化效率：K599菌株在去除主根的棉花下胚轴中诱导效率最高（26.6%），真空处理后提升至33.3%，且跨基因型适用性验证成功（图1d, 3d）。
   
2. RI非依赖性系统：A. tumefaciens携带rolABC时可诱导毛状根（效率13.3%），但效率低于K599（图4c）。
   
3. CRISPR编辑：靶向GhBASS5的sgRNA2在A/D亚基因组中均实现高效缺失突变（效率83–86%），与稳定转化株突变谱一致（图6e-f）。
   
4. 病毒介导重组：TRV-Cre系统成功将rolABC切除并激活Ruby报告基因，证实根系特异性基因调控的可行性（图7b-d）。
   
5. 根系分泌物分析：Ruby转基因根分泌甜菜红素（63.3 ng/mL），代谢组学鉴定到3209种代谢物，其中1077种差异显著，包括上调的植物激素（如3-吲哚丁酸）和下调的微生物拮抗物质（图8）。
   

结论与价值

AgroRoots系统通过非无菌条件下的高效毛状根诱导、水培富集和多功能遗传操作工具整合，为棉花根系研究提供了革命性平台。其科学价值体现在：
1. 方法学突破：首次实现土壤栽培棉花的规模化毛状根转化，解决了传统方法的无菌依赖和生理功能局限问题。
2. 应用潜力：支持基因编辑、根系-微生物互作、分泌物分析等研究，为抗逆育种和合成生物学提供技术支撑。
3. 跨物种推广：在番茄和本氏烟中的成功验证表明其潜在普适性（图S8）。

亮点

1. 高效性与可扩展性：真空渗透法使转化周期缩短至40天，适合高通量筛选。
   
2. 多技术融合：首次将CRISPR编辑、病毒递送和代谢组学整合于同一根系研究体系。
   
3. 生理相关性：水培系统维持根系自然功能，分泌物数据更贴近田间实际（对比土壤提取代谢物仅4.9%重叠，图S7）。
   

其他价值

本研究开发的rolABC替代策略和TRV-Cre系统为植物基因功能研究提供了新工具，尤其适用于需要精确时空调控的根系发育研究。此外，代谢组学数据揭示了Ri质粒对根系微环境的潜在影响，为后续根际互作机制研究奠定基础。