学术研究报告

本研究由来自日本爱媛大学工程学院应用化学系的Kairat Madin、Tatsuya Sawasaki、Tomio Ogasawara以及通讯作者Yaeta Endo*共同完成。研究论文以“a highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes”为题，于2000年1月18日发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。

学术背景 该研究属于生物技术与合成生物学领域，具体聚焦于无细胞蛋白质合成（cell-free protein synthesis， CFPS）系统的开发与应用。当时，无细胞蛋白质合成系统因其能够以高速度和高准确性合成蛋白质而备受关注，尤其适用于表达可能干扰宿主细胞生理学的毒性或复杂蛋白质。然而，当时的主流无细胞系统（无论是基于细菌提取物还是小麦胚芽提取物）普遍存在一个关键缺陷：不稳定性。这种不稳定性导致蛋白质合成反应在短时间内停止，从而使得最终蛋白质产量很低，限制了其在制备规模应用中的潜力。此前，提高效率的努力主要集中在改良反应器设计（如连续流动系统）或优化反应条件上，但均未从根本上解决提取物内在的不稳定问题。

研究团队选择小麦胚芽无细胞系统作为研究对象，因为它具备成本低、易于大规模获取、内源性背景蛋白合成活性低，以及作为真核系统更利于表达真核蛋白等诸多优势。然而，其不稳定的根源尚不明确。该研究的背景知识植根于对核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating proteins， RIPs）的认知。RIPs是一类广泛存在于高等植物中的蛋白质毒素，其作用机制是通过催化去除28S核糖体RNA上一个高度保守的腺嘌呤残基，使核糖体永久失活，从而抑制蛋白质合成。研究团队此前曾发现蓖麻毒素（ricin）的作用机制即是核糖体失活。在小麦中，存在一种名为Tritin的单链RIP，此前被认为主要存在于胚乳（endosperm）中。早期报道认为小麦胚芽的核糖体对Tritin具有抗性，这意味着在制备小麦胚芽提取物时，即使混入含有Tritin的胚乳碎片，也不会对蛋白质合成造成影响。但该研究团队对此提出了质疑。

基于以上背景，本研究的主要目标是：1. 探究小麦胚芽无细胞系统不稳定的根本原因，特别是验证Tritin等内源性抑制因子的作用。2. 开发一种能显著提高蛋白质产量和稳定性的高效、稳健的小麦胚芽无细胞蛋白质合成系统。3. 利用该系统进行大规模功能性蛋白质的制备，并探讨其对理解翻译装置稳定性及植物防御机制的意义。

详细研究流程 本研究包含两个核心部分：一是系统不稳定性的根源探究与高活性提取物的制备；二是基于该提取物构建高效批量及连续流（透析）合成系统并验证其性能。

• 流程一：不稳定根源探究与高活性小麦胚提取物制备

  • 研究对象与处理：研究起始于市售小麦种子。首先，通过粉碎、过筛（710-850微米孔径）和溶剂浮选法（使用环己烷和四氯化碳混合溶剂）初步富集完整、有活性的胚芽。然而，显微镜观察发现，通过这种常规方法得到的胚芽样品中混杂有胚乳碎片（呈现为白色物质和颗粒）。为了去除这些污染，研究团队引入了一个关键步骤：对初步筛选出的胚芽进行彻底清洗。具体方法是，将胚芽在剧烈搅拌下用10倍体积的水洗涤三次，然后在0.5% Nonidet P-40（一种非离子型去污剂）溶液中超声处理3分钟，最后再用无菌水超声洗涤一次。经过这样处理的胚芽，其污染物显著减少。
  • 实验方法与分析：
    1. 脱嘌呤分析：为了直接验证Tritin的污染及其活性，研究团队采用了脱嘌呤测定法。该方法基于RIPs的作用原理：被RIP去除腺嘌呤的核糖体RNA，在酸和苯胺处理下会在特定位点发生断裂，产生一个特征性的RNA片段，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。研究人员分别使用“未洗涤胚芽”和“洗涤后胚芽”制备细胞提取物，并在蛋白质合成反应中孵育不同时间（0-4小时），然后提取总RNA进行酸/苯胺处理和电泳分析。
    2. 提取物制备：无论是未洗涤还是洗涤后的胚芽，均采用改良的Erickson和Blobel方法制备无细胞提取物。简单流程是：将胚芽在液氮中研磨成细粉，与提取缓冲液混合，经高速离心和凝胶过滤（G-25柱）去除小分子，最终得到澄清的提取物，调整浓度后于液氮中保存。
  • 数据分析流程：通过比较未洗涤和洗涤胚芽提取物在反应过程中产生的特征性RNA片段的强度，定量评估核糖体被脱嘌呤（即失活）的比例。

• 流程二：高效蛋白质合成系统的构建与性能评估

  • 研究对象：使用上述“洗涤后胚芽”制备的高活性提取物作为核心反应组分。
  • 系统构建与实验：
    1. 批量反应系统：构建标准的50微升批量反应体系，包含提取物、能量物质（ATP， GTP， 磷酸肌酸/肌酸激酶系统）、氨基酸、镁/钾离子、tRNA、蛋白酶抑制剂等。以编码二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase， DHFR）的mRNA为模板，在26°C下孵育。通过监测掺入蛋白质的放射性标记亮氨酸（[14C]leucine）的放射性强度（热三氯乙酸不溶物）来实时追踪蛋白质合成动力学。此外，在反应进行到一定时间后，添加新的底物（氨基酸、ATP、GTP）以测试反应停止的原因是否为底物耗尽。
    2. 蔗糖密度梯度离心分析：为了评估翻译活性，在批量反应的不同时间点（如0、1、2小时）取样，通过蔗糖密度梯度离心分离核糖体组分。通过监测260 nm吸光度，可以直观地看到核糖体单体（80S）、二聚体及多聚体（Polysomes）的分布。多聚体的形成是活跃翻译（多个核糖体同时结合在一条mRNA上）的直接证据。他们还使用了低浓度放线菌酮（cycloheximide，一种翻译延伸抑制剂）处理，观察其对多聚体分布的影响，以评估翻译起始的效率。
    3. 透析反应系统（连续流制备规模）：为实现大规模、长时间合成，研究团队采用了透析袋系统。将500微升反应混合物置于截留分子量为12,000-14,000的透析袋中，浸入含有相同成分（不含肌酸激酶）的外部缓冲液（5毫升）中。该系统允许底物从外部缓冲液连续扩散进入反应体系，同时反应产生的代谢废物（如无机磷酸盐）扩散出去。反应在23°C下进行，每24小时补充一次新的mRNA模板和肌酸激酶，并更换外部缓冲液。该系统用于合成多种蛋白质：DHFR、荧光素酶（luciferase， 65 kDa）、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP， 45 kDa）以及烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus， TMV）的126 kDa复制酶蛋白。
  • 产物分析与数据采集：
    1. 产量测定：通过SDS或天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物，用考马斯亮蓝染色。通过光密度扫描，与已知浓度的标准品蛋白条带对比，定量计算合成蛋白的量。对于TMV大蛋白，由于缺乏纯品，通过与电泳内参分子量标准品的条带强度比较进行估算。
    2. 活性验证：测定合成蛋白的生物学活性以确认其正确折叠和功能。DHFR的活性通过其与甲氨蝶呤（methotrexate）结合的能力（亲和柱纯化）和比色法酶活测定来验证。荧光素酶的活性使用商业试剂盒和液体闪烁计数器测定。GFP的荧光活性通过在紫外灯下观察天然胶上的荧光条带强度，并与标准品比较来半定量评估。
    3. 合成时长验证：为证明系统在长时间后仍有活性，在DHFR合成反应52小时后，向反应混合物和外部缓冲液中均加入[14C]亮氨酸，继续孵育至72小时，然后通过SDS胶和放射自显影（autoradiography）检测新合成的、带有放射性标记的蛋白质条带。

主要结果 * 关于不稳定根源：脱嘌呤分析的结果至关重要。使用“未洗涤胚芽”提取物进行的反应显示，即使在反应开始时（0小时），已有7%的核糖体RNA被脱嘌呤；随着反应进行至4小时，被脱嘌呤的核糖体比例上升至24%。这个特征性片段被证实来源于28S rRNA的S/Ricin结构域。而直接从胚芽组织中用异硫氰酸胍-酚法提取的RNA则几乎没有该片段，证明脱嘌呤主要发生在提取物制备过程和随后的蛋白质合成反应中，而非胚芽细胞内固有。相反，使用“洗涤后胚芽”提取物进行的反应，在任何时间点都检测不到该特征片段，表明脱嘌呤活性（即Tritin污染）已被有效去除。这一结果直接否定了“小麦胚芽核糖体对Tritin有抗性”的旧观点，并证实胚乳来源的Tritin污染是导致系统不稳定的关键因素之一。 * 批量系统性能提升：蛋白质合成动力学数据清晰地展示了清洗带来的巨大改进。使用24%浓度的“洗涤后胚芽”提取物，DHFR合成在4小时内呈近乎线性增长。而相同浓度的“未洗涤胚芽”提取物，反应在1.5小时后即停止。将“洗涤后胚芽”提取物浓度提高至48%，初始合成速率加倍，但约1小时后因底物耗尽而停止；此时补充底物可立即重启翻译，且速率与初始相近。这表明该系统具有很高的内在活性，停止是可逆的。然而，对于48%浓度的“未洗涤胚芽”提取物，反应活性反而低于24%浓度组，且停止后补充底物也无法重启，表明存在不可逆的损伤。蔗糖密度梯度分析提供了更直接的证据：“洗涤后胚芽”系统在孵育1小时后即观察到显著的多聚体形成，2小时后多聚体峰增大且80S单核糖体峰减少。在低剂量放线菌酮存在下，多聚体大量累积（78%核糖体处于多聚体状态），表明翻译起始效率非常高。相比之下，“未洗涤胚芽”系统即使在无抑制剂的情况下也几乎不形成多聚体。 * 透析系统实现大规模、长时间合成：这是本研究应用价值的集中体现。 * 产量与时长：使用DHFR mRNA，在补充新鲜mRNA的情况下，透析系统可持续高效工作60小时，从1毫升反应体积中产出高达4 mg具有酶活性的DHFR。若不补充mRNA，则在24小时后停止，产量为1 mg。 * 多聚体持续形成：在透析反应进行了48小时和60小时后取样，加入放线菌酮孵育1小时，蔗糖梯度离心仍显示显著的多聚体形成，直接证明了即使在长时间反应后，系统仍保持着旺盛的翻译活性。 * 大分子量蛋白合成：系统成功合成了65 kDa的荧光素酶（1.1 mg/mL）、45 kDa的GFP（1.2 mg/mL）以及高达126 kDa的TMV复制酶蛋白（0.6 mg/mL）。合成的荧光素酶和GFP比活性与商品化重组蛋白相当甚至更高。 * 超长时程活性验证：对于TMV蛋白的合成，实验设计尤为巧妙：在52小时反应后加入[14C]亮氨酸，继续孵育至60和72小时。放射自显影显示，在60小时（即加入标记物后8小时）和72小时（加入标记物后20小时）都能清晰检测到新合成的放射性TMV蛋白条带，且信号强度呈线性增长。尽管此时氨基酸掺入总速率仅为初始的21%，但这无可辩驳地证明了翻译装置在持续工作超过3天后，仍能有效合成超大分子量蛋白。

结论与意义 本研究的结论是多层次且深刻的： 1. 技术结论：成功开发了一种从彻底清洗的小麦胚芽制备的高效、稳健的无细胞蛋白质合成系统。该系统在批量模式下可连续翻译4小时，在透析模式下可持续工作超过60小时，能高产量地合成从几十到超过一百千道尔顿的各种功能性蛋白质。 2. 生物学发现：研究揭示了植物（以小麦为例）中存在针对自身翻译装置的自杀系统（suicide system）。这一系统由储存在胚乳等组织中的RIPs（如Tritin）以及可能的其他抑制剂（如硫堇蛋白、核糖核酸酶）构成。当细胞因病原体入侵（如病毒）而受损时，这些抑制剂可能被释放，通过失活核糖体来阻止病原体复制，从而以局部细胞的牺牲换取整体的防御。这为植物RIPs的生物学功能提供了有力解释。 3. 颠覆性观点：本研究挑战了当时普遍认为“无细胞翻译系统天生不稳定、脆弱”的观点。结果表明，一旦清除了内源性抑制剂，翻译装置本身在体外（及推想在体内）是非常稳定的。这种稳定性或许是生命进化的基本要求，使得蛋白质合成这一核心生理过程即使在不利条件下也能进行。 4. 普适性策略：研究团队提出的通过消除内源性翻译抑制剂来提高无细胞系统效率的策略，被认为同样适用于其他系统（如大肠杆菌系统）。

研究亮点 1. 关键问题发现：没有停留在优化反应条件的层面，而是深入探究了小麦胚芽系统不稳定的根本原因，即胚乳来源的RIP（Tritin）等抑制剂污染，这是一个关键的机制性发现。 2. 简单有效的解决方案：针对根源问题，采用了彻底清洗胚芽这一看似简单但极其有效的物理方法去除污染物，从而大幅提升了系统性能。方法具有成本低、可扩展性强的优点。 3. 卓越的性能指标：所开发的系统在蛋白质合成的持续时间、产量（特别是对于大分子量蛋白）以及产物活性方面，在当时达到了显著领先水平。 4. 基础与应用紧密结合：研究不仅解决了一个重要的技术问题，获得了高性能的蛋白质生产平台，还由此得出了关于植物防御机制和翻译装置稳定性的重要生物学见解，体现了转化研究的价值。 5. 严谨的实验设计：通过脱嘌呤分析直接证明Tritin的污染与活性；通过底物补充实验区分“底物耗尽”和“不可逆损伤”；通过长时间后添加放射性标记物的实验，无可争议地证明了系统的持续合成能力，设计精巧，证据链完整。

其他有价值内容 研究还指出，该系统作为真核系统，能更好地表达真核蛋白，无需对cDNA进行修饰；由于其模板降解率低，适用于核糖体展示（polysome display）等需要长mRNA稳定的技术；是研究翻译过程本身（如mRNA环化现象、非翻译区功能）的有力工具。这些拓展应用前景进一步提升了该研究的价值。