研究论文报告

主要作者及研究机构 本文题为《用于可编程靶向超突变的多样性生成逆转录元件》，发表于 *Nature Biotechnology*，发表时间为2026年3月。主要通讯作者为来自法国巴黎西岱大学巴斯德研究所合成生物学单元的Raphael Laurenceau与David Bikard。共同第一作者为Paul Rochette、Elena Lopez-Rodriguez及Raphael Laurenceau。其他合作者分别来自美国加州大学旧金山分校、格拉德斯通研究所及法国巴黎高等师范学院物理实验室等多个顶尖研究机构。

研究背景 定向进化旨在模拟自然选择，以获取具有优良性状的蛋白质变体。传统的遗传多样性产生多依赖于体外（in vitro）方法，如易错PCR（error-prone PCR）或DNA文库合成，这些步骤繁琐且难以实现连续进化。因此，在活体细胞（in vivo）内直接对目标基因进行靶向突变，是该领域长期追求的目标。 自然界中存在一种名为多样性生成逆转录元件（Diversity-Generating Retroelements, DGRs）的系统，最早发现于博德特氏菌噬菌体BPP-1中。该系统通过逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）在腺嘌呤（adenine）位点引入高频率突变。然而，由于DGR系统在常见实验室菌株中天然缺失，且其异源重组机制不明，一直未能转化为通用的遗传工具。本研究旨在克服这一障碍，建立了将DGR与单链DNA重组工程（recombineering）相结合的DGRec方法，实现大肠杆菌中任意目标序列的定向超突变。

详细研究流程与实验设计 研究建立了一套模块化的DGRec系统，其核心工作流程分为构建、诱导突变、表征及应用验证四个阶段。 在第一阶段，研究者重构了来自博德特氏菌噬菌体BPP-1的DGR系统。将博德特氏菌逆转录酶（Bordetella RT, bRT）和辅助变异性决定因子（Accessory Variability Determinant, Avd）的编码序列进行密码子优化后，置于化学诱导型启动子（如诱导bRT的dapg诱导型phlF启动子）之下。同时，引入了来自PortMAGE系统的重组工程模块，包括促进单链DNA退火的蛋白CspRecT，以及用于失活错配修复通路的显性负性等位基因MutL*，该模块由间甲基苯甲酸（m-toluic acid）诱导。通过改变向导RNA（dgrRNA）上的模板重复序列（Template Repeat, TR），即可重编程突变靶点。 在第二阶段，系统通过将可变重复区（Variable Repeat, VR）整合到染色体、质粒或噬菌体上。为了验证系统功能，研究首先针对大肠杆菌中的sacB计数筛选标记基因进行实验。设计了一个70bp的TR与其完美互补。在dapg和间甲基苯甲酸诱导下，经过48小时培养（包含两次1：1000的系列传代），与催化失活的bRT对照组相比，实验组产生了约1000倍更多的蔗糖抗性菌落。Sanger测序证实了突变主要集中在腺嘌呤位点。 在第三阶段的高通量表征中，研究使用了独特的分子标识符（UMIs）进行扩增子测序以排除PCR偏差。结果显示，48小时内高达9.7%的群体在sacB上发生了突变，腺嘌呤位点的每代每碱基突变率达到9.3×10⁻⁴。为探究bRT的序列偏好性，研究者构建了一个包含702条随机TR序列的文库，进行了高深度的自靶向突变实验。分析揭示，bRT在腺嘌呤上的平均错误率为33.2%，而在胸腺嘧啶上为1.7%。更关键的是，突变率受短程序列背景显著影响：当+1位置为鸟嘌呤（G）时，腺嘌呤突变率降至26.8%；而为胞嘧啶（C）时则升至42.4%。特别是AAC和ACC密码子中的腺嘌呤突变率高达约56.0%，且存在“滚雪球效应”。通过三元图，研究还揭示了序列背景对碱基引入的精细调控，例如AG二核苷酸倾向于引入G，从而避免了终止密码子（AAG、AGA）的产生，体现了bRT的进化适应特征。此外，研究利用ViennaRNA包发现，dgrRNA的二级结构（特别是TR与间隔区之间的自由能差异∆E）是决定诱变效率的关键，并据此建立了预测模型，验证了41%的新设计TR具有高功能。 在应用验证流程中，研究探索了多个场景。首先是噬菌体-宿主共进化。利用DGRec靶向大肠杆菌的LamB受体蛋白环状结构域和λ噬菌体的受体结合蛋白gpJ的C端结构域。实验成功分离出对LamB突变体具有重新感染能力的gpJ变体，模拟了自然界中的“军备竞赛”动态。其次是针对dCas9蛋白的进化。通过在dCas9的PAM相互作用域插入终止密码子，再通过DGRec诱变修复并筛选结合新PAM的变体，成功获得了新的功能性dCas9。最后是纳米抗体亲和力成熟。利用细菌表面展示技术，针对SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域，对VHH-1.29纳米抗体的CDR3区进行多轮“诱变-筛选”循环，最终获得了对武汉株和Beta株RBD亲和力分别提高4.2倍和3.3倍的变体。在酵母中，研究也通过结合CRISPR-Cas9切割和同源定向修复进行了原理验证，检测到了腺嘌呤特异性编辑。

主要结果与结论 本研究成功开发了DGRec系统，实现了在50-200bp窗口内、最高达每代每碱基1.38×10⁻²的突变率，且能在48小时内积累多达24个突变。核心科学发现在于详尽揭示了bRT的序列偏好性图谱：腺嘌呤主要受其+1和+2位核苷酸调控，这种机制在最大化AAC等密码子多样性的同时，最大限度地减少了终止密码子的出现。系统模块化的设计允许其在单质粒或双质粒体系中运行，并能同时对多个位点进行诱变。 DGRec的应用价值在于其突破了传统体外诱变的局限，提供了一种在体内对特定蛋白质结构域进行密集且可控突变的全新工具。与EvolvR、MutaT7等方法相比，其独特优势在于能够通过设计TR中的腺嘌呤位置，精准控制多样化位点，尤其适用于结合界面或催化口袋等蛋白质结构域的快速序列空间探索。

研究亮点 本研究的亮点主要体现在三个方面。其一，方法学的创新：成功利用单链DNA重组工程将DGR元件转化为可编程遗传工具，绕过了自然系统中依赖IMH序列进行逆转录归巢的限制。其二，机制解析的系统性：通过高通量测序和随机文库筛选，首次在活体细胞中系统量化了DGR逆转录酶的序列上下文偏好，并解析了dgrRNA二级结构对效率的影响，为理性设计TR提供了依据。其三，应用场景的广泛性：证明了该系统不仅适用于大肠杆菌基因组和质粒，还能在噬菌体进化、CRISPR工具改造、纳米抗体亲和力成熟乃至真核生物酵母中发挥作用，展示了巨大的生物技术潜力。不过，DGRec系统目前也存在CspRecT表达带来的适应性代价导致系统在长期进化中失活，以及TR自突变导致的腺嘌呤丢失等问题，这些也为未来的改进指明了方向。