肠道上皮MHC II类分子诱导致脑炎性CD4 T细胞并启动中枢神经系统自身免疫

研究背景

多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种中枢神经系统（central nervous system, CNS）的自身免疫性疾病，传统上被认为源于神经组织中的免疫监视失调。然而，近年来的研究表明胃肠道与CNS自身免疫之间存在密切关联，肠道中的免疫教育过程可能影响神经炎症性疾病的发生发展。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）这一MS的小鼠模型中，肠道共生菌或特定微生物已被证明对疾病的启动和进展至关重要。这些微生物信号能够刺激髓鞘反应性T细胞，并促进其分化为能够浸润CNS的致病性T辅助17（T helper 17, Th17）细胞。然而，肠道来源的信号如何通过细胞机制传递给免疫系统进而影响CNS导向的自身免疫，此前尚不清楚。

传统上认为，专业抗原提呈细胞（antigen-presenting cells, APCs）如树突状细胞（dendritic cells, DCs）是诱导Th17细胞所必需的。但近期研究提示，肠道上皮细胞（intestinal epithelial cells, IECs）可作为非经典APCs发挥作用。在稳态条件下，分节丝状菌等共生微生物可诱导小肠IECs表达主要组织相容性复合体II类（major histocompatibility complex class II, MHC II）分子；在炎症状态下，结肠IECs响应干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）上调MHC II表达。尽管已有这些发现，IEC来源的MHC II在启动自身免疫性CD4 T细胞和驱动CNS炎症中的功能作用仍不明确。

研究目的与总体设计

本研究旨在阐明IECs在EAE中作为致脑炎性CD4 T细胞诱导位点的作用，并检验IEC表达的MHC II是否通过直接抗原提呈促进具有CNS归巢潜能的Th17分化。研究者综合运用了人类样本单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、条件性基因敲除小鼠、联体共生（parabiosis）、光转换细胞追踪、体外类器官-T细胞共培养等多种技术手段，系统性验证了肠道上皮MHC II在神经炎症启动中的关键作用。

第一部分：MS患者肠道上皮与免疫细胞特征分析

研究者首先对来自MS患者（n=4）和健康对照（healthy controls, HCs; n=3）的回肠末端活检样本进行了scRNA-seq分析。无监督聚类识别出23个不同的细胞群，包括IEC亚群（肠上皮细胞、肠道干细胞、转运扩增细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞）、免疫细胞（DCs、CD4和CD8 T细胞、B细胞亚群和巨噬细胞）以及内皮细胞和成纤维细胞。

在免疫细胞群中，MS患者的CD4 T细胞比例显著富集。对CD4 T细胞进行亚聚类分析后识别出五个不同亚群：Th1、滤泡辅助T细胞样CD4 T、初始CD4 T、中间态CD4 T以及Th17/Th1混合细胞。与HCs相比，MS患者中Th1和Th17/Th1混合细胞扩增，而调节性T细胞（regulatory T cells, Treg cells）比例降低。模块评分显示，MS患者CD4 T细胞中Th1和Th17相关基因表达升高，Treg相关基因表达降低，表明存在促炎性T辅助细胞偏斜。

在IEC群体中，MS患者的成熟肠上皮细胞比例增加。差异基因表达分析显示，肠上皮细胞中参与淋巴细胞募集（CCL25）、抗原提呈（IRF1、CD74和CIITA）和抗微生物防御（REG1A、REG3A和ALPI）的基因上调，而杯状细胞功能和黏液屏障完整性相关基因（MUC2、TFF3、CLCA1等）下调。MHC II主调控因子CIITA不仅表达于经典APCs（以ITGAX标记），也表达于上皮细胞群（以EPCAM标记），证实了MS中上皮细胞MHC II相关基因的上调。抗原提呈模块评分在MS患者IECs中显著升高，而经典APCs的抗原提呈模块评分在两组间相当。此外，MS患者IECs的IL-17A/IFN-γ响应模块评分显著高于HCs。这些结果表明，MS患者肠道以增强的上皮抗原提呈和Th17偏斜的免疫格局为特征。

第二部分：EAE小鼠中IEC上调MHC II和抗原提呈通路

为验证人类发现，研究者对EAE小鼠的回肠上皮层进行了bulk RNA测序。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示，EAE小鼠IECs中与抗原加工和MHC提呈相关的通路显著上调。MHC I类和II类相关基因（H2-Eb1、H2-K1、H2-D1、H2-Aa、H2-Ab1、CD74和B2M）的表达水平在EAE小鼠IECs中显著升高。

流式细胞术验证显示，EAE小鼠中小肠DCs和B细胞的数量和频率以及CD45+CD11b+ APCs中MHC II+细胞的比例与对照相当，但总IEC群体中MHC II+细胞的数量和比例均显著增加。MHC II的平均荧光强度在EAE小鼠IECs中高于对照，而经典APCs中则低于对照。CD80（共刺激分子）的表达频率在EAE小鼠IECs中呈上升趋势。解剖定位分析显示，MHC II表达在稳态下回肠最高；EAE期间小肠各段IECs的MHC II表达均显著增加，以回肠最为显著，而结肠中未检测到MHC II+ IECs。此外，EAE小鼠肠道中IL-17A+和IFN-γ+ CD4 T细胞数量增加，与MS患者的关键特征相一致。

第三部分：IEC特异性MHC II缺失减轻EAE严重程度

为评估上皮MHC II在EAE发病中的功能，研究者构建了可诱导的IEC特异性H2-Ab1缺失小鼠（Villin-CreERT2:H2-Ab1flox/flox; 称为IECΔMHCII小鼠），并与同窝Cre阴性对照（EAE小鼠）一同进行MOG35-55免疫。流式细胞术证实IECs中MHC II表达被选择性消除，而经典CD45+ APCs中保持完整。

IECΔMHCII+EAE小鼠的临床评分显著降低，脊髓中免疫浸润和脱髓鞘减轻。CD4 T细胞总数减少，其中Th17细胞数量减少最为显著，Th1和Th1/17细胞群也显著减少。为排除专业APCs的贡献，研究者在MOG免疫后的早期（第-4和-1天）或晚期（第14和17天）耗竭CD11c+细胞，发现任一阶段的耗竭均未改善EAE临床评分，脊髓中Th1、Th17和IFN-γ+IL-17A+ CD4 T细胞数量在各组间相当。这些结果表明，上皮MHC II对EAE期间CNS中致病性Th17细胞的积累至关重要。

第四部分：上皮MHC II对小肠中致病性Th17诱导不可或缺

scRNA-seq分析EAE和IECΔMHCII+EAE小鼠的小肠细胞，共识别出27个细胞簇。在CD4 T细胞亚聚类中，致病性Th17群体以高表达PRDM1、IL23R和CXCR6为特征，而这一群体在IECΔMHCII+EAE小鼠中的比例低于EAE小鼠。

流式细胞术分析小肠上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes, IELs）和固有层淋巴细胞（lamina propria lymphocytes, LPLs）显示，IECΔMHCII+EAE小鼠中Th17LPL、Th1IEL、Th17IEL和Th1/Th17IEL细胞的数量和比例显著降低。MOG再刺激后，LPL和IEL区室中产生IL-17A的CD4 T细胞在IECΔMHCII+EAE小鼠中均减少。免疫荧光分析显示，MOG免疫在对照小鼠中导致CD4+CXCR6+ T细胞在LPL和IEL区室的强劲积累，而这一扩增在IECΔMHCII小鼠中显著受损。这些发现表明，IECs中的MHC II表达对EAE期间肠道中致脑炎性Th17细胞的局部扩增是必需的。

第五部分：肠道固有层CD4 T细胞在EAE期间迁移至CNS

利用Kaede转基因小鼠的光转换细胞追踪系统，研究者在疾病发作前（第7天）和发作期（第14天）对末端回肠进行选择性光激活，48小时后分析组织。结果显示，LPL区室中光转换红色CD4 T细胞的百分比在第7天和第14天均较对照降低，提示这些细胞在疾病两个阶段均从肠道区室主动外流。相反，IEL区室中红色CD4 T细胞的比例在所有时间点保持稳定。在脊髓中观察到红色CD4 T细胞的显著积累（第14天），肠系膜淋巴结和脾脏中亦有所增加。进一步分析CXCR6+亚群发现，IEL区室中约70-80%的光转换CD4+CXCR6+ T细胞留在原处，而LPL区室中这一群体的比例在48小时内进行性下降，并在EAE期间积累于脊髓。这些结果说明，LPL区室（而非IEL区室）中的CXCR6+ CD4 T细胞优先离开肠道并在EAE晚期参与CNS浸润。

第六部分：上皮MHC II对致脑炎性Th17的诱导必需但对效应功能非必需

联体共生实验将MOG免疫的CD45.1+野生型小鼠与CD45.2+野生型或IECΔMHCII小鼠连接，或将免疫的IECΔMHCII小鼠与野生型或IECΔMHCII小鼠连接。结果显示，免疫小鼠的EAE临床评分取决于其自身的上皮MHC II表达：野生型免疫小鼠（组1和2）比IECΔMHCII免疫小鼠（组3和4）发展出更严重的EAE。非免疫小鼠的EAE严重程度在组1和2之间相似，但在组3和4中显著降低，无论其自身是否表达上皮MHC II。脊髓中来自免疫伙伴的CD4 T细胞比例在组1和2中高于组3。这些数据表明，致脑炎性CD4 T细胞在肠道中以MHC II依赖性方式被诱导。

过继转移实验中，将体外完全分化的2D2 MOG特异性Th17细胞转移到对照或IECΔMHCII小鼠中，两组的临床EAE评分相当，脊髓和小肠中MOG特异性Th17细胞的频率和数量亦相似。这表明一旦完全分化的致脑炎性T细胞已生成，上皮MHC II对疾病的效应阶段并非必需。

为探究上皮MHC II呈递的是微生物抗原还是内源性自身抗原，研究者用广谱抗生素鸡尾酒（氨苄青霉素、万古霉素、新霉素和甲硝唑）处理小鼠。抗生素处理显著降低了EAE临床评分，并减少了小肠中MOG反应性Th17细胞的百分比，但IECs的MHC II表达水平在两组间相当。这提示微生物来源的抗原（而非仅内源性自身抗原）对EAE发病是必需的。

第七部分：EAE与IECΔMHCII+EAE小鼠上皮细胞的转录组差异

对肠道上皮区室进行scRNA-seq分析，识别出14个不同的上皮细胞簇。EAE小鼠富集了祖细胞早期、祖细胞晚期-1、未成熟肠上皮细胞-1和成熟肠上皮细胞-1簇，而IECΔMHCII+EAE小鼠则显示祖细胞晚期-2、未成熟肠上皮细胞-2和成熟肠上皮细胞-2簇比例较高。GO和差异表达分析显示，EAE小鼠肠上皮细胞中抗原提呈通路优先富集，CD74、CTSB、LGMN、CD80和CD86等抗原提呈相关基因显著上调。簇特异性分析表明，H2-Ab1在肠道干细胞和整个肠上皮细胞谱系中表达，以成熟肠上皮细胞-1中水平最高。IL-17应答基因和IFN-γ应答基因主要富集于成熟肠上皮细胞-1中。

第八部分：上皮细胞以MHC II依赖性方式直接极化CD4 T细胞

为直接验证IECs能否以MHC II依赖性方式极化CD4 T细胞，研究者建立了IEC-T细胞共培养系统，使用IFN-γ处理的小肠类器官和预活化的CD4MOG-TCR T细胞。IFN-γ诱导类器官上MHC II的强表达。共培养结果显示，仅在存在同源MOG肽且无MHC II阻断抗体的条件下，CD69+、RORγt+和CXCR6+ CD4MOG-TCR细胞的频率显著增加，而Tbet+细胞的频率无显著变化。MHC II阻断或去除MOG抗原均消除了这种极化效应。这提供了直接的体外功能证据，证明IEC表达的MHC II足以以抗原依赖性方式驱动预活化CD4 T细胞的Th17极化。

结论与意义

本研究揭示了肠道上皮MHC II在EAE中致脑炎性CD4 T细胞生成中的关键作用，确立了一条此前未知的肠-CNS免疫学轴。IECs在神经炎症信号作用下上调MHC II，通过直接抗原提呈促进具有CNS归巢潜能的Th17分化。上皮MHC II的条件性缺失减少了致病性Th17细胞的生成并减轻疾病严重程度。人类MS患者中IECs的MHC II相关基因上调以及CXCR6+ CD4 T细胞的富集表明该肠-CNS轴在人类疾病中具有保守性。鉴于肠道上皮对饮食、微生物和药理学干预的可及性，靶向IEC-T细胞相互作用可能为MS及相关疾病提供一种此前未被认识的免疫调节治疗策略。

研究亮点

本研究的核心创新在于：（1）首次证明了IECs而非专业APCs是EAE中致脑炎性Th17细胞诱导的关键位点；（2）通过联体共生和光转换追踪技术，直接展示了肠道固有层CD4 T细胞向脊髓的迁移；（3）利用IEC特异性MHC II条件性缺失小鼠，明确了上皮抗原提呈在疾病启动阶段（而非效应阶段）的必要性；（4）通过类器官-T细胞共培养系统提供了上皮细胞直接驱动Th17极化的体外功能证据；（5）将小鼠模型发现与人类MS患者样本相印证，展示了一条保守的肠-CNS自身免疫轴。