本研究的主要作者是Patrick Wittmeier和Susanne Hummel，两人均来自德国哥廷根大学历史人类学与人类生态学系。这项研究以《Agarose gel electrophoresis to assess PCR product yield: comparison with spectrophotometry, fluorometry and qPCR》为题，于2022年3月在线发表，并于同年4月正式刊载在学术期刊*Biotechniques*第72卷第4期。
学术背景 该研究的科学领域主要属于分子生物学和生物技术，特别是聚合酶链式反应（PCR）产物的定量分析方法。在分子生物学研究中，准确评估PCR产物的产量对于下游应用至关重要，例如测序或毛细管电泳片段长度分析，这些步骤通常要求PCR产物浓度在特定范围内才能正常进行。目前，有多种方法可用于定量溶液中的核酸浓度，例如分光光度法（spectrophotometry）、荧光测定法（fluorometry）或定量实时PCR（quantitative real-time PCR， qPCR）。琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）则是一种相对便宜且易于使用的方法，常被用来评估PCR反应的成功与否。通过在凝胶中加入染料或嵌入剂（如溴化乙锭，EtBr），可以在紫外灯下观察DNA条带。传统的观点认为，通过条带亮度来估计PCR产物产量是不精确的，因此该方法不适用于定量评估。然而，基于研究者的经验，琼脂糖凝胶电泳有可能进行半定量或至少是粗略的产量估计，这对于许多下游应用已经足够。因此，本研究旨在更仔细地评估琼脂糖凝胶电泳用于评估PCR产物产量的适用性，并与其他三种定量方法进行比较。
具体而言，本研究的目标是：通过量化琼脂糖凝胶上DNA条带的亮度，并将这些数据与分光光度法、荧光测定法和qPCR的测量结果进行比较，以检验琼脂糖凝胶电泳评估PCR产物产量的精确度和可靠性。研究者希望验证，对于长度相似的扩增子，基于条带亮度的相对定量是否足够精确，以满足后续分析步骤的需求。
详细工作流程 本研究包含一系列严谨的实验步骤，旨在对比不同定量方法。
首先，是样本准备与PCR扩增。研究共使用了十个DNA样本，其中八个为使用EZ1 DNA组织试剂盒从口腔拭子中提取的样本，另外两个是商业化的对照DNA标准品（9947A和9948）。对于每一个DNA样本，研究者使用不同量的DNA模板进行了两次独立的PCR反应，以产生长度约为130 bp的扩增片段。该片段位于2号染色体长臂靠近乳糖酶基因的区域。具体的PCR组分、反应参数及引物序列均在补充材料中列出。这一步是产生待评估的PCR产物的基础。
其次，是初始的琼脂糖凝胶电泳评估。为了初步测试PCR的成功与否，研究者制备了2.5%的琼脂糖凝胶。他们特别强调了凝胶制备的均匀性对于后续评估的重要性。与常用的微波炉加热不同，他们使用磁力加热搅拌器缓慢加热溶解琼脂糖粉末，以确保完全溶解。在煮沸后，将溴化乙锭加入凝胶中并充分混匀，然后浇注入制胶板。这种方法旨在确保凝固后的凝胶外观高度均匀。待凝胶凝固后，将PCR产物与上样染料混合并加样到凝胶孔中。电泳在100伏电压下进行45分钟。电泳完成后，使用开源图像处理软件ImageJ对条带亮度进行量化。具体流程是：生成泳道曲线图（lane plot profiles），圈定峰值区域，并测量峰面积。在评估前，建议扣除背景信号以提高准确性。图1a展示了扣除背景后的原始凝胶图像，图1b则展示了根据ImageJ测得的亮度值虚拟重排后的条带图像，这代表了一种基于亮度的相对定量排序。详细的凝胶制备、图像处理和亮度评估步骤在补充材料1中提供。此步骤的核心是获取每个PCR产物条带的相对亮度值，作为“凝胶法”的量化指标。
第三步，是PCR产物的纯化。由于后续的分光光度法和荧光测定法需要纯化的PCR产物进行分析，研究者使用核酸纯化柱对剩余的PCR产物进行了纯化。为了考虑纯化过程中可能存在的产物损失，他们在与第一步完全相同的条件下，再次进行了琼脂糖凝胶电泳。图2展示了纯化后PCR产物的凝胶图像，其条带顺序按照图1b的亮度顺序进行了虚拟重排。对比图1b和图2，可以直观地评估纯化步骤对产物量的影响。
第四步，是三种标准定量方法的平行测量。这是本研究的核心比较环节。 1. 分光光度法：使用Denovix公司的DS-11 FX+分光光度计/荧光计及其双链DNA（dsDNA）吸光度应用进行测量。每个样本测量五次，每次使用1微升纯化后的PCR产物。每次测量同一样本前后，都清洁样品台；测量不同样本前，则用超纯水冲洗样品台并进行新的空白校准。 2. 荧光测定法：使用同一台DS-11 FX+仪器及其Fluoro dsDNA应用，并配合Denovix dsDNA高灵敏度检测试剂盒进行。为每个样本准备两份独立的检测混合液（分别含2微升和3微升PCR产物），每份混合液测量三次，以提高数据的可靠性。该方法特异性检测双链DNA。 3. 定量PCR（qPCR）：使用Roche公司的LightCycler 2.0系统和Qiagen的Quantifast SYBR Green PCR试剂盒进行。首先，使用对照DNA标准品9948的PCR产物建立标准曲线，采用从1:200到1:3200的1:2倍比稀释系列。标准曲线的初始浓度基于荧光测定法的数据确定。对于待测样本，为每个纯化后的PCR产物准备了1:500和1:1000两种稀释度，每个稀释度取2微升进行三重重复分析。
第五步，是数据分析与比较。研究者将四种方法（凝胶亮度、分光光度法、荧光测定法、qPCR）得到的结果进行整合比较。图3以图表形式展示了所有样本按初始凝胶亮度排序后的四种方法测量结果。数据分析的重点在于观察不同方法得出的浓度趋势是否一致，以及评估各方法间的绝对浓度差异和测量重现性。
主要结果 研究结果清晰地展示了不同定量方法的表现和关联。
首先，关于凝胶亮度的相对定量能力。如图3所示，尽管在纯化步骤后，由于各样本产物损失程度不同，样本按亮度精确排序的序列被轻微打乱，但四种方法呈现出的总体浓度从左到右递增的模式是一致的。这说明，基于琼脂糖凝胶条带亮度对长度相似的扩增子进行相对定量和排序是可行的，且具有较好的精确度。这一发现挑战了“凝胶电泳不适用于定量评估”的普遍观点。
其次，关于不同方法间绝对浓度的比较。研究数据显示，分光光度法测得的PCR产物浓度总体最高。研究者分析，这可能是因为所采用的纯化步骤未能完全去除所有引物，而分光光度法无法区分单链和双链DNA，会将所有吸光物质（包括残留引物）计算在内。相比之下，荧光测定法使用的检测试剂盒特异性结合双链DNA，因此其测量结果更能代表目标扩增产物的实际浓度。qPCR测得的浓度与荧光测定法结果相似，这主要是因为建立标准曲线时使用了荧光测定法的数据进行校准。这一对比揭示了不同方法原理差异导致的测量偏差。
第三，关于各方法的重现性和灵敏度。研究指出，分光光度法的结果在各样本间最为均匀（剔除一个明显异常值后）。而qPCR结果显示的样本间差异最为显著，方差最大。此外，研究者发现样本4在qPCR检测中是一个异常值，其1:1000稀释度计算出的浓度比1:500稀释度高约30%，这很可能是在制备该样本稀释液时出现了移液误差。这个细节也反映了实验操作对qPCR这种高灵敏度方法结果的影响。
第四，关于纯化步骤的影响。通过比较纯化前后的凝胶图像（图1b与图2），以及观察所有方法结果中出现的浓度顺序微小变动，研究者证实了纯化过程会导致不同样本产生不同程度的PCR产物损失。这种损失在所有方法的测量结果中都有体现，在凝胶电泳、荧光测定法和qPCR的结果中尤为明显。这表明在进行跨方法比较或需要绝对定量的下游应用时，必须考虑纯化步骤的效率一致性。
这些结果相互印证，从不同角度支持了研究的核心结论。
结论 本研究得出结论：在扩增子片段长度相似且浓度处于所述范围内的情况下，琼脂糖凝胶电泳适用于比较PCR反应后的产物产量，从而实现相对定量。这通过基于凝胶条带亮度能够比较精确地对PCR产物浓度进行排序而得到证明。许多下游分析步骤，如毛细管电泳片段长度分析或PCR参数评估，并不需要确定绝对的PCR产物浓度。本研究结果表明，琼脂糖凝胶电泳完全能满足这些需求。
然而，研究者强调，要获得可靠的相对定量结果，需要精心制备琼脂糖凝胶，重点是确保琼脂糖粉末完全溶解以及溴化乙锭在凝胶中均匀分散。他们采用的缓慢加热搅拌法就是为了实现这一目标。
研究的意义与价值 本研究的科学价值在于，它通过系统的实验设计和多种方法的平行比较，为琼脂糖凝胶电泳这一经典技术的半定量应用提供了实证支持。它挑战了该技术不适用于定量评估的固有印象，明确了其适用的场景和边界条件（即长度相似的扩增子，以及非绝对定量的需求）。其应用价值非常直接：对于众多分子生物学实验室，特别是资源有限或需要高通量初步筛查的实验室，本研究证实了无需依赖昂贵仪器，仅通过精心优化的琼脂糖凝胶电泳和图像分析，即可对PCR产物进行有效的相对定量评估，从而为下游实验步骤（如测序模板的等量混合）提供指导，节省时间和成本。
研究亮点 1. 重要的发现：明确论证了在严格控制条件下，基于溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳条带亮度可以比较精确地反映长度相似PCR产物的相对浓度，为这一广泛使用但常被低估定量价值的技术正名。 2. 方法的新颖性/特殊性：研究并非简单对比，而是引入了严谨的图像分析流程（使用ImageJ软件进行背景扣除和峰面积定量），将主观的“目测亮度”转化为可量化的数据指标，增强了比较的科学性。同时，研究者特别强调并详细描述了旨在获得高度均匀凝胶的制备方法（如使用磁力加热搅拌器），这是确保结果可重复性的关键。 3. 严谨的比较设计：研究没有停留在定性描述，而是将“凝胶法”与三种公认的定量标准方法（分光光度法、荧光测定法、qPCR）进行平行、系统的比较，并考虑了纯化步骤带来的影响，使得结论更具说服力。
其他有价值的内容 研究在“未来展望”部分指出，尽管琼脂糖凝胶电泳已有近50年历史，它仍然是分离PCR产物等的可靠方法。当用它评估PCR反应成功与否时，条带亮度不仅能指示反应成败，还能提供关于产物相对量的额外信息。这可以用于需要产物浓度在特定范围内的下游应用，从而省去额外的定量步骤。这进一步强调了本研究结论对实际科研工作的指导意义。此外，研究提供的详细补充材料（包括凝胶制备细节、图像处理步骤和原始数据表格）为其他研究者重复和借鉴该方法提供了便利。