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碱基编辑技术创制广谱抗ALS抑制剂除草剂水稻的研究
1. 研究团队与发表信息
本研究由Rui Zhang、Sha Chen、Xiangbing Meng等共同完成，通讯作者为Linjian Jiang（中国农业大学）、Jiayang Li和Caixia Gao（中国科学院遗传与发育生物学研究所）。研究成果发表于《Science China Life Sciences》2021年10月第64卷第10期，标题为《Generating broad-spectrum tolerance to ALS-inhibiting herbicides in rice by base editing》。
2. 学术背景
科学领域：植物基因编辑与作物抗除草剂育种。
研究动机：杂草威胁全球粮食生产，而传统转基因抗除草剂作物面临监管和公众接受度问题。水稻作为主粮作物，亟需非转基因且高效的抗除草剂解决方案。
背景知识：
- ALS基因（乙酰乳酸合成酶基因，acetolactate synthase）是支链氨基酸合成的关键酶，也是五类ALS抑制剂除草剂（如磺酰脲类、咪唑啉酮类）的作用靶点。
- 碱基编辑技术（base editing）可在不引入DNA双链断裂的情况下实现单碱基精准编辑，避免传统诱变育种的高成本和复杂性。
研究目标：通过碱基编辑水稻ALS基因（OsALS），创制对多类ALS抑制剂除草剂具有广谱耐受性的水稻品种。
3. 研究流程与方法
（1）碱基编辑载体构建与转化
- 载体设计：使用pH-BE3载体（含胞嘧啶脱氨酶和nCas9融合蛋白），针对OsALS的两个关键位点（P171和G628）设计sgRNA。
- 转化方法：通过农杆菌介导法将编辑载体导入水稻品种“中花11”的愈伤组织，获得T0代转基因植株。
- 样本量：
- OsALS-P171靶点：20株T0植株，其中7株（35%）仅含碱基替换，11株（55%）含插入/缺失突变（indel）。
- OsALS-G628靶点：8株T0植株，4株（50%）含碱基替换。
- 双靶点编辑（P171+G628）：26株T0植株，5株（19.2%）含双位点碱基替换。
（2）突变类型鉴定
- P171位点：产生5种错义突变（P171S、P171F、P171A、P171Y、P171F/R172C），其中P171F由连续3个胞嘧啶（C→T）编辑导致。
- G628位点：获得G629S和G628E/G629S突变（G→A转换）。
- 双靶点突变：创制了P171F/G628E/G629S三重突变体。
（3）脱靶效应分析
- 通过CRISPR-P软件预测脱靶位点，仅发现OsALS同源基因（OsALS-off1和OsALS-off2）存在低频率编辑，且这些基因在水稻中表达量极低，对表型无显著影响。
（4）抗性表型评估
- 温室实验：测试突变体对五类ALS抑制剂除草剂（如烟嘧磺隆、咪草烟）的耐受性。
- P171单突变体：对烟嘧磺隆（40 g/ha）完全耐受，但对咪草烟耐受性较弱。
- 三重突变体P171F/G628E/G629S：对五类除草剂均表现最高耐受性（耐受32倍田间推荐剂量）。
- 田间试验：
- P171F和P171F/G628E/G629S在烟嘧磺隆处理下无产量损失，且株高降低可能增强抗倒伏性。
- 三重突变体对双草醚（bispyribac）的耐受性显著优于单突变体。
（5）结构生物学分析
- 通过同源建模解析OsALS与除草剂的结合机制：
- P171F突变：通过空间位阻阻碍磺酰脲类除草剂结合。
- G628E突变：改变咪唑啉酮类除草剂的结合口袋构象。
- 三重突变协同作用，扩大除草剂结合位点的空间排斥。
4. 主要研究结果
- 编辑效率：单靶点碱基替换效率达35%~50%，双靶点效率为19.2%。
- 抗性谱扩展：三重突变体首次实现同时对五类ALS抑制剂的高耐受性。
- 田间适用性：P171F/G628E/G629S在除草剂处理下产量与野生型无差异，且无生长缺陷。
5. 研究结论与价值
科学价值：
- 证实碱基编辑可高效创制多基因位点协同突变的作物新种质。
- 阐明了ALS基因不同位点突变对抗除草剂谱的差异化贡献。
应用价值：
- 为非转基因抗除草剂水稻育种提供技术路线，尤其适合亚洲直播稻区的杂草治理。
- 三重突变体可支持轮作系统中短效除草剂的使用，减少土壤残留。
6. 研究亮点
- 方法创新：首次将碱基编辑用于ALS基因多位点协同突变，克服传统诱变的随机性。
- 广谱抗性：P171F/G628E/G629S突变体对五类化学结构迥异的除草剂均表现耐受性。
- 田间验证：通过大田试验证实突变体的农艺性状稳定性，兼具抗倒伏潜力。
7. 其他价值
- 研究揭示了碱基编辑在作物复杂性状改良中的潜力，为其他抗逆性状（如抗病、抗旱）的精准设计提供参考。
- 提出的“多重突变叠加”策略可推广至其他除草剂靶标基因（如EPSPS、ACCase）。
（报告总字数：约1500字）