本研究由河北医科大学整合医学研究所的孔德志（Dezhi Kong）、张伟（Wei Zhang）、张盼盼（Panpan Zhang）课题组主导完成，第一作者为吴怡颖（Yiying Wu）、闫静文（Jingwen Yan）和陈玉婷（Yuting Chen）。该项研究成果于2026年6月28日在线发表于国际分析化学领域权威期刊Analytica Chimica Acta（第1419卷，文献号345903），论文题为《Reduction-alkylation proteome profiling (RAPP): A novel strategy for proteome-wide target identification》。
药物靶标蛋白的发现是现代药物研发中最关键的环节之一，深入了解靶标蛋白信息能够揭示药物的作用机制和疾病发生发展的分子基础。目前，基于质谱（mass spectrometry, MS）的蛋白质组学已成为药物靶标鉴定的核心工具，其策略主要分为两类：基于修饰的方法和免修饰方法。基于修饰的方法，如活性导向蛋白谱分析（activity-based protein profiling, ABPP）和亲和选择质谱（affinity selection mass spectrometry, AS-MS），需要共价标记靶标蛋白，但化学修饰可能意外改变小分子的生物活性或结合特异性，导致实验准确性降低。而免修饰策略以热蛋白质组谱分析（thermal proteome profiling, TPP）为代表，能够在无需标记的条件下实现无偏倚的药物靶标检测，应用广泛。然而，不同的免修饰方法各有局限，亟需开发新的靶标鉴定方法以补充现有技术。
二硫键在稳定蛋白质空间结构、调控蛋白质功能以及影响配体结合方面发挥关键作用。在常规蛋白质组学工作流程中，还原和烷基化步骤会不可逆地破坏蛋白质内和蛋白质间的二硫键，促进蛋白质去折叠并被蛋白酶消化。基于此原理，研究团队提出科学假设：在非变性蛋白质裂解液中，配体结合可能改变二硫键的稳定性，使得经配体处理的蛋白质在相同还原和烷基化条件下表现出与未处理蛋白质不同的稳定性。这种稳定性差异可通过不同的还原条件被检测到，进而用于药物靶标鉴定。基于这一假设，研究者旨在建立一种全新的免修饰靶标鉴定方法——还原烷基化蛋白质组谱分析（reduction-alkylation proteome profiling, RAPP）。
本研究建立并系统验证了RAPP策略，其详细工作流程包含以下关键步骤：
（1）蛋白质裂解液的制备与配体孵育
研究者使用非变性条件制备蛋白质裂解液。人类HEK293T细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，待细胞融合度达80%时收集。细胞经预冷PBS洗涤后，使用含100 mM HEPES（pH 7.0）、1%蛋白酶抑制剂混合物、1 mM MgCl₂和0.1% DDM的裂解缓冲液在冰上裂解30分钟，随后进行三次冻融循环（液氮速冻，37°C融化至50%冰晶融化后置于冰上），最后在4°C下以20,000 g离心10分钟收集上清。小鼠皮层组织则采用磁珠研磨和超声处理相结合的方式提取蛋白质。所有蛋白质浓度均采用Bradford法测定。
裂解液分别与受试配体或溶剂对照在25°C、800 rpm条件下孵育30分钟。本研究使用了多种模型配体：星形孢菌素（staurosporine，20 μM）、草氨酸盐（oxamate，20 μM）、恩他卡朋（entacapone，50 μM）以及ATP（0.8 mM）。
（2）关键参数的优化
在建立RAPP方法前，研究者对多个关键实验参数进行了系统优化。首先测定了烷基化试剂碘乙酰胺（iodoacetamide, IAM）的最佳浓度，发现当IAM终浓度达到40 mM及以上时，上清液中蛋白质浓度基本恒定，表明在此条件下变性和沉淀完全，因此选择40 mM IAM用于后续实验。其次，测试了不同离子强度的影响，发现较低的三乙基碳酸氢铵（triethylammonium bicarbonate, TEAB）浓度（即较低离子强度）会导致给定还原剂浓度下蛋白质沉淀增加，最终选择中等浓度30 mM TEAB。此外，对IAM孵育时间（0.5、1、1.5和2小时）的评估显示，延长反应时间会增加总体变性程度和变异性，综合蛋白质沉淀和烷基化效率选择了1小时作为优化反应时间。研究者还通过Western blot验证了看家蛋白β-肌动蛋白（ACTB）和GAPDH的反应差异性：ACTB随还原剂浓度升高变得不可检测，而缺乏二硫键的GAPDH保持稳定，这不仅支持了RAPP方法的可行性，还确立了GAPDH作为Western blot内参蛋白的适用性。
（3）梯度浓度RAPP工作流程
用于构建蛋白质变性曲线。配体孵育后的裂解液等分为6份，分别加入终浓度为5、10、15、20、25和30 mM的二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT），在37°C、800 rpm条件下还原反应1小时，随后加入40 mM IAM在25°C、600 rpm避光条件下烷基化反应1小时。反应混合物在4°C下以10,000 g离心10分钟后收集上清。以5 mM DTT组（最低还原剂浓度）的50 μg蛋白质作为参考体积，各组取相同体积进行后续处理。加入六倍体积预冷丙酮在-20°C沉淀蛋白质6小时，离心后重新溶解于50 mM TEAB中，以1:50的酶/蛋白质量比加入胰蛋白酶（trypsin）在37°C消化14小时。肽段经SPE柱脱盐纯化后真空干燥，用于质谱分析。
（4）单浓度RAPP工作流程
用于阳性药物靶标验证。每个验证实验设置四个独立生物学重复，每个重复的裂解液分为两份，分别用于配体处理和溶剂对照。所采用的DTT浓度设定在靶标蛋白变性曲线的陡峭区域，接近其半最大还原浓度（half maximal reduction concentration, dm），以最大化检测配体诱导稳定性变化的灵敏度。据此策略，星形孢菌素组采用16和18 mM DTT，草氨酸盐组采用25 mM DTT，恩他卡朋组采用18 mM DTT。
（5）剂量-响应RAPP工作流程
用于验证草氨酸盐与LDHA的特异性结合。裂解液与浓度梯度的草氨酸盐孵育（10⁻⁶·³至10⁻³·⁹ M），随后在与单浓度草氨酸盐RAPP相同的条件下进行还原烷基化。
（6）质谱分析与数据处理
肽段样品在配备Orbitrap Fusion质谱仪的Vanquish Neo UHPLC系统上进行分析，采用数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）模式。质谱数据使用DIA-NN软件（1.8版）和人/小鼠UniProt FASTA数据库进行分析。对于梯度浓度实验，以最低DTT浓度点为参照计算各蛋白的相对丰度，使用公式f(d) = (1 - plateau) / (1 + e^[-(a/(d - b))]) + plateau拟合变性曲线，并计算半最大变性还原剂浓度dm值。δdm（δdm = dm₍₊₎ - dm₍₋₎）用于评估配体结合引起的蛋白质稳定性变化。对于单浓度定量分析，采用分位数归一化和经验贝叶斯方法进行统计分析。
（1）RAPP方法的建立与验证
研究首先通过牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）与肝素的结合实验验证了RAPP的可行性。加入肝素作为配体显著增强了BSA在20 mM DTT和40 mM IAM条件下的稳定性（图S3）。梯度还原条件下，肝素处理组相较于溶剂对照组表现出显著增强的稳定性，证实RAPP能够反映靶标蛋白与配体之间的结合相互作用。值得注意的是，该方法在14,000 g离心条件下验证成功，且不同于TPP，无需超速离心。将离心力降低至10,000 g仅导致曲线右移，仍可检测到肝素-BSA结合。
（2）全局蛋白质稳定性谱分析
研究者进行了RAPP条件下的全局蛋白质稳定性谱分析。随着还原剂浓度增加，质谱定量的总蛋白丰度呈S形下降。经严格筛选（拟合优度r² > 0.8且满足缺失值标准），共获得3280个蛋白质的dm值。两次生物学重复的dm值相关性分析显示高度重现性（r² = 0.991）。
dm值分布分析揭示蛋白质主要聚集在15-20 mM范围内形成主峰，同时在22-25 mM处观察到次级峰，表明存在高dm值的蛋白质亚群。基于dm范围的蛋白质分类和代表性蛋白结构分析表明：低dm蛋白Cxa1仅含少量二硫键（图2e），中dm蛋白Apob展现丰富的二硫键网络（图2f），高dm蛋白Lama2具有复杂的二硫键网络（图2g）。使用Discovery Studio的预测分析进一步证实，高dm蛋白（≥25 mM）中92.6%预测含有二硫键，而低dm蛋白（≤10 mM）中仅62.5%预测具有二硫键（图2d），直接证实了dm值与二硫键富集程度之间的正相关关系。
基因本体（gene ontology, GO）分子功能富集分析揭示了不同dm分布范围蛋白质的功能差异：低dm组（高敏感性组）显著富集ATP依赖性二酰甘油激酶活性、蛋白质跨膜转运活性等功能，主要与膜相关磷脂代谢和跨膜转运有关；中dm组富集5.8S rRNA结合、蛋白酶体激活活性等功能；高dm组（高耐受性组）富集旋转机制质子转运ATP酶活性、核输入信号受体活性等功能。此外，蛋白酶体核心颗粒（core particle, CP）和调节颗粒（regulatory particle, RP）在RAPP中表现出显著不同的稳定性：RP随还原剂浓度升高发生显著变性，而CP变性敏感性低得多。
尤为重要的是，RAPP相比传统TPP展现出独特优势：在RAPP数据集中，有295个满足拟合标准但在TPP中无法产生可辨识熔解曲线的蛋白质（表S1），这些蛋白质的dm值中位数为15.7 mM，表明其对还原剂DTT更敏感，能够在RAPP体系中呈现清晰的变性响应。
（3）星形孢菌素靶标鉴定
以星形孢菌素为模型配体验证RAPP的靶标鉴定能力。鉴于总激酶群体的dm中位数为17 mM，选择16和18 mM两个DTT浓度进行检测。在16 mM DTT组获得5392个蛋白质的完整定量值，18 mM组获得5305个。采用最低2% p值作为显著性阈值，16 mM组鉴定到59个蛋白质，18 mM组鉴定到58个蛋白质表现出星形孢菌素诱导的溶解性变化。其中相当大比例（16 mM组85%，18 mM组93%）由蛋白激酶、ATP结合蛋白或与激酶直接相互作用的蛋白质复合物组分构成。
在稳定化激酶靶标中，18 mM DTT组的中位log₂溶解性变化（0.4）显著高于16 mM组（0.21），表明较高DTT浓度可放大了药物结合诱导的构象稳定信号。激酶家族覆盖度分析显示，18 mM DTT富集了CAMK、AGC和CMGC等主要家族，而16 mM DTT提供了更广泛的激酶家族谱。此外，RAPP在鉴定TK/TKL家族激酶方面较传统热稳定性方法更具优势，克服了此类激酶因高内在热稳定性而难以通过热变性区分药物结合状态的局限。
（4）草氨酸盐和恩他卡朋靶标鉴定
草氨酸盐处理后观察到乳酸脱氢酶A（LDHA）稳定性显著变化，以及延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白1（FAHD1）的稳定性显著改变。剂量-响应实验证实，LDHA的相对稳定性随草氨酸盐浓度升高呈显著的剂量依赖性增加，并在高浓度时达到平台，明确证实了特异性结合。而FAHD1的稳定性虽也随浓度逐步增加，但响应曲线未达到饱和平台，表明结合作用相对较弱。分子对接模拟显示出草氨酸盐可进入FAHD1活性位点，预测结合能为-5.452 kcal/mol，与实验观察到的较弱亲和力一致。
恩他卡朋处理后，其已知靶标儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）的蛋白质稳定性发生显著变化。以-log p > 1.5为阈值共鉴定到112个潜在靶标。GO富集分析显示显著富集于GTP酶活性、突触囊泡胞吐调节、膜定位、P型钠钾交换转运活性等功能条目，与恩他卡朋作为COMT抑制剂提高多巴胺水平、影响突触神经递质释放网络的已知药理学机制高度吻合。
（5）RAPP与TPP的系统比较
使用同批次HEK293T细胞裂解液，RAPP获得3284个蛋白质的完整稳定性曲线，TPP获得3494个。采用经典筛选标准（r² > 0.8，平台值 < 0.3，δtm > 1.5°C或δdm > 1.5 mM），RAPP和TPP分别鉴定到301和320个差异调节蛋白，交集仅26个，表明两种方法在捕获蛋白质稳定性变化方面具有显著互补性。在已知ATP结合蛋白鉴定中，RAPP覆盖11.8%（101/856），TPP覆盖12.1%（104/856），两者联合覆盖达22.1%（189/856），较单一方法提升约10%。代表性蛋白APAF1在RAPP还原梯度下表现出显著稳定性响应，而在TPP中仅显示微小热稳定性变化，反之PFKM则在TPP中显示大幅热位移而在RAPP中变化可忽略，证实两种方法对蛋白质-配体相互作用的不同生物物理方面敏感。
本研究成功建立了一种基于差异还原烷基化反应的蛋白质组范围配体靶标鉴定新方法——RAPP。该策略具有多项关键优势：采用受控化学还原方法而非热变性，提供了更好的实验控制，且无需热循环仪和超速离心机等专用设备；与下游蛋白质组学工作流程无缝兼容，减少样品制备时间；可通过质谱或Western blot验证配体-靶标相互作用。RAPP不仅成功验证了星形孢菌素、草氨酸盐和恩他卡朋的已知靶标，还发现FAHD1作为草氨酸盐先前未被识别的结合靶标，提示其检测弱结合事件的潜力。该方法揭示了蛋白质组在还原条件下的稳定性差异，并补充了传统TPP无法捕获的295个蛋白质的变性曲线，可作为经典免修饰配体靶标鉴定方法的重要补充策略，在化学生物学和药物发现研究中具有实际应用价值。
本研究的突出亮点可归纳如下：第一，提出了基于还原烷基化原理的全新靶标鉴定策略，利用二硫键稳定性变化检测配体结合，为蛋白质组学领域贡献了原创性方法；第二，RAPP操作流程温和简便，无需复杂操作或专门设备，实验可控性强；第三，成功捕获了TPP遗漏的蛋白质群体，证明两种方法在蛋白质稳定性检测方面具有正交互补性；第四，通过低丰度弱结合事件（如草氨酸盐与FAHD1）的检测，展现了该方法的高灵敏度。
尽管RAPP展现出显著优势，但研究者也客观指出其当前局限性：该方法目前尚不能直接应用于完整细胞，可能导致遗漏某些依赖细胞内环境的靶标；其检测能力依赖于半胱氨酸残基和二硫键的存在，缺乏这些结构特征的蛋白质可能无法被有效捕获。未来研究方向可包括：将RAPP扩展至其他还原剂和烷基化试剂的组合，如TCEP与碘乙酸（iodoacetic acid, IAA）；以及将TPP与RAPP整合，系统解析不同生理条件下药物靶标的相互作用特征。