该文档是一篇原创研究论文，通讯作者为南京师范大学生命科学学院的迟伟（Wei Chi），共同第一作者为郭银杰（Yinjie Guo）、张佳睿（Jiarui Zhang）和曹婷（Ting Cao）。研究发表于 New Phytologist 期刊，文章于2026年2月4日收到，2026年3月16日接受，刊载于2026年第251卷第11–17页。论文标题为《转位子亚基TIC56双重定位于叶绿体和线粒体并调控两种细胞器中的rRNA积累》。
该研究所属的科学领域为植物细胞生物学与细胞器生物学，重点关注核编码蛋白向叶绿体和线粒体的靶向运输机制。线粒体和叶绿体起源于内共生事件，虽然保留了自身基因组，但其功能高度依赖核基因编码并在细胞质中合成的蛋白质。在植物中，约1000种线粒体蛋白和3000至4000种叶绿体蛋白在细胞质中合成后被分别导入相应细胞器。这一过程通常由细胞器特异的靶向信号和专用的蛋白导入机器介导。然而，存在一类被称为双靶向蛋白（dual-targeted proteins）的特殊蛋白，能够同时定位于线粒体和叶绿体。已知植物中双靶向主要通过两种机制实现：一是由可变翻译起始产生的双生转运肽（twin transit peptides），二是由单一肽段介导的模糊双靶向转运肽（ambiguous dual-targeting transit peptide）。尽管已有生物信息学工具如模糊靶向预测器（Ambiguous Targeting Predictor）发现了越来越多的双靶向候选蛋白，但双靶向现象的功能意义和机制基础仍不清楚。TIC56是叶绿体内膜转位子复合体（TIC complex）中一个已被充分鉴定的组分，除了参与蛋白质导入，TIC56还参与叶绿体rRNA加工和核糖体组装。本研究旨在探究TIC56是否具有双重定位能力，以及其在线粒体中的潜在功能与靶向机制。
研究首先通过瞬时表达和稳定转基因实验分析TIC56的亚细胞定位。在拟南芥叶肉原生质体中瞬时表达时，TIC20-GFP呈现预期的围绕叶绿体的环状定位，而TIC56-GFP则呈点状分布，与线粒体标记FRO1-YFP共定位，提示其线粒体定位。为排除瞬时表达系统的局限，研究者在稳定转基因植株中进一步验证。在叶肉细胞中，TIC56-GFP与叶绿体自发荧光精确重叠；而在根细胞中，TIC56-GFP呈离散点状，与MitoTracker Red部分共定位。该模式在TIC56自身启动子驱动下依然存在，排除了异位过表达造成的假象。共表达TIC56-GFP和线粒体标记FRO1-YFP显示，叶肉细胞中二者不共定位，而根细胞中明显重叠。因此，TIC56具有细胞类型特异的双靶向性：在光合组织中定位于叶绿体，在根中定位于线粒体。进一步分析表明，大豆TIC56和衣藻TIC56在稳定转基因拟南芥中也表现出叶片叶绿体定位和根线粒体定位，说明这种细胞类型特异的双靶向性在绿色植物中具有保守性。作为对照，TIC20-GFP仅在叶绿体中定位，在根中无线粒体信号，表明双重定位是TIC56的特异性特征，而非TIC复合体组分的普遍特性。
随后，研究探讨线粒体定位的TIC56是否参与线粒体蛋白质导入。利用一个TIC56蛋白第244位氨基酸发生点突变的突变体tic56-4，该突变体呈现较弱的淡绿表型。免疫印迹分析显示，核编码的线粒体蛋白AOX积累未发生变化，而核编码的叶绿体蛋白明显减少，说明TIC56并非通用的线粒体蛋白导入因子。然而，线粒体编码蛋白COX1和COX2水平在突变体中下降，提示线粒体翻译可能受影响。由于叶绿体TIC56为叶绿体rRNA积累所必需，研究者假设线粒体TIC56可能同样影响线粒体rRNA。RNA凝胶印迹证实，tic56-4突变体中叶绿体23S和16S rRNA明显下降；线粒体26S rRNA丰度显著降低，18S rRNA仅轻微下降。这些结果表明，双靶向的TIC56在两种细胞器中均参与rRNA积累。此外，tic56突变体表现出根生长和发育延迟，但尚不能完全排除质体功能障碍的间接影响。
进一步，研究解析了TIC56靶向线粒体的机制。TIC56具有一个预测为叶绿体转运肽的N端48个氨基酸区域。瞬时表达一系列N端截短与GFP的融合蛋白显示，预测的转运肽（TIC56₁₋₄₈ aa）不能将GFP靶向叶绿体或线粒体；延伸至200 aa仍无细胞器靶向能力；而300 aa的N端片段（TIC56₁₋₃₀₀ aa）能有效将GFP定位到线粒体，并能将成熟TIC20（TIC20₆₆₋₂₇₄ aa）重定向至线粒体。稳定转基因实验中，TIC56₁₋₄₈ aa-GFP在叶肉细胞中与叶绿体自发荧光共定位，确认其叶绿体靶向功能，但在根细胞中未检测到GFP信号，说明该区域不足以实现向非绿色质体的定位。通过免疫印迹分析成熟形式，发现线粒体中成熟TIC56蛋白迁移速度快于叶绿体中的对应蛋白，表明两种细胞器对TIC56前体进行了不同的加工。这一结果排除了TIC56使用共同转运肽介导双靶向的可能性，也否定了模糊转运肽机制。
为揭示TIC56线粒体靶向信号与典型叶绿体转运肽的相互作用，研究者构建了TIC20转运肽与TIC56的融合蛋白。TIC20的N端65个氨基酸转运肽（TIC20₁₋₆₅ aa）足以将GFP靶向叶绿体。当TIC56缺失N端48个氨基酸后（TIC56₄₉₋₅₂₆ aa）融合到TIC20转运肽C端时，融合蛋白在叶片和下胚轴中定位于叶绿体；在根细胞中虽有GFP信号积累，但与线粒体标记完全不重叠，提示其可能被导入根细胞的非绿色质体。然而，当全长TIC56融合到TIC20转运肽C端时，融合蛋白在叶片和下胚轴中呈现点状荧光，在线粒体标记可靠的根细胞中，GFP信号与MitoTracker大量重叠，确认线粒体定位。这说明TIC56的线粒体靶向信号在体内能够覆盖或压制TIC20转运肽的叶绿体靶向活性，表现出显性效应。
综合以上结果，研究得出以下结论：TIC56通过一种非典型途径被靶向线粒体。其线粒体导入依赖于一个异常长的N端区域，而非短线性信号；序列保守结构域和结构模体均不能单独指导线粒体靶向。线粒体与叶绿体中成熟TIC56的加工形式不同，排除了共同转运肽机制。TIC56的线粒体靶向信号能够显性压制典型叶绿体转运肽TIC20 TP的功能。研究推测TIC56可能通过类似酵母UPS蛋白的脂质辅助、亲和力驱动的非经典导入途径进入线粒体，因为TIC56是可溶性蛋白、能与膜脂结合，并且通过N端与TIC100/CTAP3等伙伴相互作用。TIC56在叶肉细胞中只靶向叶绿体而不进线粒体，可能存在细胞类型特异的线粒体导入受体或辅助因子，或者叶绿体转运肽与叶绿体导入受体的亲和力高于线粒体信号与其受体的亲和力。尽管不能完全排除TIC56在根细胞中被错误靶向至线粒体进行降解的可能性，但TIC56缺少跨膜结构域、在线粒体中具有可检测的稳定积累，因此该假说不太可能是主要机制。
本研究的意义在于揭示了转位子组分TIC56细胞类型特异的双靶向现象及其在两种细胞器rRNA积累中的保守功能，更新了对细胞器蛋白质靶向调控的认识。研究还发现了一种非典型的线粒体导入方式，其线粒体靶向信号可显性覆盖典型叶绿体转运肽的功能，为理解双靶向蛋白的分子机制以及协调细胞器间蛋白质组动态提供了新视角。研究亮点包括：首次证明TIC56以细胞类型特异方式双重定位于叶绿体和线粒体；发现线粒体定位的TIC56参与线粒体rRNA积累；揭示了TIC56依赖非典型途径进入线粒体，且其靶向信号具有显性压制叶绿体转运肽的能力。