主要作者与机构
本研究由张智博（Zhibo Zhang）和侯振宇（Zhenyu Hou）为共同第一作者，通讯作者为牛志涛（Zhitao Niu）和丁小余（Xiaoyu Ding），来自南京师范大学生命科学学院、铁皮石斛国家林业和草原局重点实验室等机构。该论文发表于 *Frontiers in Plant Science*，2026年6月10日在线发表。
学术背景
AP2/ERF（APETALA2/乙烯响应因子）转录因子家族是植物胁迫响应和发育过程的关键调控因子。该超家族依据保守结构域组成可划分为AP2、ERF、RAV和Soloist四个家族，其中ERF家族又分为DREB和ERF两个亚家族。在模式植物拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中已鉴定出147个AP2/ERF成员，水稻中有139个，玉米中有214个。尽管该家族在多种植物中已被系统研究，但在药用兰科植物铁皮石斛（*Dendrobium officinale*）中相关研究仍十分匮乏。铁皮石斛被誉为“九大仙草之首”，其活性成分包括多糖、石斛碱和黄酮类化合物。其中花青素（anthocyanidin）作为黄酮类化合物的重要一类，不仅赋予植物色彩以吸引传粉昆虫，还能清除紫外线辐射产生的活性氧。AP2/ERF成员已被证实在多种植物中参与花青素生物合成的调控。本研究旨在基于7个不同生境铁皮石斛个体的泛基因组数据，系统鉴定和分析AP2/ERF基因家族，并对其关键成员DoERF109_2进行功能验证。
研究流程与实验设计
本研究采用了系统的生物信息学分析与实验验证相结合的策略。首先，研究团队从安徽霍山、浙江天目山、浙江乐清、广东丹霞山、浙江雁荡山等不同生境采集了7个铁皮石斛个体（分别命名为dof、hxl、tm、tp1、tp4、hs和yd），利用改良CTAB法提取基因组DNA，并通过Illumina HiSeq 2500和PacBio Sequel II双平台进行高通量测序。利用Hi-C辅助数据，采用Hifiasm（v0.18.5）软件完成基因组组装，以BUSCO评估组装完整性。
在基因家族鉴定环节，研究者采用了HMMER和BLASTp联合策略：以AP2/ERF保守结构域模型（pf00847）和B3结构域模型（pf02362）进行HMM搜索，同时以拟南芥AP2/ERF全基因集进行BLASTp比对，取两种方法结果的并集作为候选基因。随后利用NCBI CDD和SMART网站在线工具验证保守基序和功能结构域，并使用ProtParam进行理化性质分析。通过ClustalX进行多序列比对，以MEGA X构建邻接法（neighbor-joining）系统发育树，参照拟南芥的分类框架对铁皮石斛AP2/ERF基因进行系统分类。
在泛基因组分析层面，研究者对所有鉴定成员进行了存在-缺失变异（presence-absence variation, PAV）分析，将77个非冗余成员划分为核心基因（core, 29个）、软核心基因（softcore, 28个）、非必需基因（dispensable, 17个）和私有基因（private, 3个）。利用TBtools中的简单Ka/Ks计算器进行选择压力分析，并通过TBtools的基因定位可视化工具完成染色体定位。转座子元件分析采用EDTA（extensive de-novo TE annotator）软件，以默认参数进行全基因组转座子注释。亚细胞定位预测通过CELLO v2.5服务器完成。
在转录组与表达分析阶段，研究团队对dof个体分别进行低温（4°C）、常温（22°C）和高温（30°C）处理，在不同时间点（4h、8h、12h、16h、20h、24h）采集叶片样本。利用TRIzol法提取总RNA，通过Agilent 2100生物分析仪评估RNA质量，采用DESeq2进行差异表达基因分析（筛选标准为p-adj < 0.05且|log2FC| ≥ 1）。对候选基因DoERF109_2通过qRT-PCR进行表达模式验证，设置4个生物学重复和3个技术重复。
功能验证部分包括三个层次的实验。亚细胞定位实验：将DoERF109_2编码序列克隆至pCAMBIA1300-35S-EGFP载体，转化农杆菌GV3101后注射本氏烟草叶片，利用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光信号。铁皮石斛瞬时表达实验：将DoERF109_2克隆至pCAMBIA1301-35SN载体，注射铁皮石斛叶片，第三天后取样进行qPCR分析。烟草瞬时表达实验：将DoERF109_2、DoMYB47、Rosea1和AtANS按不同组合（阳性对照Rosea1:AtANS = 1:1，实验组DoERF109_2:DoMYB47:AtANS = 1:1:1，DoMYB47:AtANS = 1:1）共浸润烟草叶片，7天后观察拍照并提取花青素含量进行统计分析。
主要研究结果
在7个铁皮石斛个体中分别鉴定到101、76、113、123、113、105和113个AP2/ERF基因，其中tp1个体数量最多，hxl个体最少。PAV分析将77个非冗余成员分为29个核心基因（37.66%）、28个软核心基因（36.36%）、17个非必需基因（22.07%）和3个私有基因（3.90%）。与拟南芥的147个成员相比，铁皮石斛的AP2/ERF家族呈现显著的进化收缩（evolutionary contraction）现象，77个拟南芥成员在铁皮石斛中有同源基因，70个成员未检测到同源物。然而，部分ERF成员发生了谱系特异的复制事件，例如ERF109在7个个体中分别有2、2、4、4、3、4、4个拷贝，RAP2.11分别有5、2、4、6、3、3、4个拷贝。
系统发育分析将铁皮石斛AP2/ERF成员归入15个类群：Soloist、AP2、RAV和ERF（I-X、VI-L、Xb-L），其中ERF I-IV属于DREB亚家族，ERF V-X属于ERF亚家族。除ERF Xb-L亚家族外，其他所有亚家族在铁皮石斛中均有同源基因。AP2亚家族成员数量在各类群中最为丰富。
选择压力分析显示，在核心、软核心和非必需基因中，共鉴定出25个基因在不同个体间呈现Ka/Ks > 1的正选择信号，分布于14个亚家族，包括ERF36、ERF109和CRF5等。其余绝大多数基因Ka/Ks < 1，处于纯化选择作用下。转座子元件分析发现，77个成员中有53个（占68.8%）含有转座子片段，分布于14个亚家族，表明转座子插入是基因演化中普遍且持续的事件，且未被强烈负选择清除。在核心基因中，除DoFPUCHI、DoERF98和DoERF111外，其余均含有转座子片段。
染色体定位分析显示，dof个体的AP2/ERF成员分布于18条染色体（缺少第8号染色体），而其他6个个体则分布于全部19条染色体。在少数区域观察到2至4个基因组成的串联重复簇，例如dof个体第15号染色体上存在一个由4个基因组成的串联重复对。
转录组分析揭示，低温处理下大多数上调基因在24小时才呈现显著上调，而DoFPUCHI、DoRAP2.11_2和DoERF58等在8小时即已上调。高温条件下大多数基因呈现立即下调，仅少数基因在24小时后上调。在低温组中筛选出8个差异表达成员，高温组中筛选出12个。qRT-PCR验证表明，DoERF109_2在高温胁迫下表达下调，低温胁迫下无显著变化。
亚细胞定位预测结果显示，74.87%的成员定位于细胞核，14.65%定位于叶绿体，7.12%定位于细胞质。共聚焦显微镜观察证实DoERF109_2严格定位于细胞核。铁皮石斛瞬时表达实验显示，DoERF109_2过表达后花青素途径关键酶基因DoFCHI的表达显著下调。烟草瞬时表达实验中，DoMYB47+AtANS浸润区域出现黄色斑点，而添加DoERF109_2后颜色变化不明显，花青素含量测定显示实验组与对照组存在统计学显著差异，表明DoERF109_2抑制花青素生物合成。
结论与价值
本研究首次在泛基因组水平系统鉴定了铁皮石斛AP2/ERF基因家族，揭示了该家族相较于拟南芥的显著进化收缩现象，同时发现了谱系特异的基因复制事件。核心-软核心-非必需-私有基因的分类体系揭示了一套可能参与基本功能的保守基因集，而可变基因可能贡献于局部生态适应。Ka/Ks分析显示仅有少数基因受到正选择，且多为近期复制的基因，支持新功能化假说。转座子元件的广泛存在表明TE插入是一个持续进行的过程，可能产生调控多样性。温度胁迫下的表达谱分析揭示了功能分化：冷胁迫诱导逐渐上调，而热胁迫导致大多数基因下调。核定位的DoERF109_2通过抑制DoFCHI表达和减少色素积累负调控花青素生物合成。
研究亮点
本研究的突出亮点在于：首次利用泛基因组策略而非单一参考基因组对铁皮石斛AP2/ERF家族进行分析，能够揭示个体间的存在-缺失变异和选择压力差异；结合系统发育、转座子分析、选择压力分析和表达谱分析的多维度整合研究框架；发现并功能验证了DoERF109_2作为花青素合成负调控因子，为解析铁皮石斛花青素积累的调控网络提供了候选基因；研究结果为铁皮石斛的品质评价和分子育种提供了重要的基因资源。