这是一项由意大利帕多瓦大学生物系的 Lucia Manni、Federico Caicci、Virginia Vanni，斯坦福大学霍普金斯海洋站的 Chiara Anselmi，以及米兰大学环境科学与政策系的 Silvia Mercurio 和 Roberta Pennati 共同完成的原创性研究。该研究发表于 *Journal of Marine Science and Engineering*，文章于2021年11月30日投稿，2021年12月20日被接收，并于2021年12月24日正式发表。

从学术背景来看，海鞘（ascidian）是一类固着生活的海洋无脊椎动物，隶属于被囊动物亚门（Tunicata），在演化上与脊椎动物亲缘关系较近。其生活史中包含一个可自由游动的幼虫阶段，该幼虫负责扩散并选择适宜的附着基质，随后经历变态发育成为固着成体。幼虫的解剖结构在不同物种中存在差异，其中一个关键概念是“成体化”（adultation），即成体结构在幼虫阶段提前分化的程度。玻璃海鞘（*Ciona intestinalis*）作为独居型海鞘的模式物种，其幼虫结构相对简单，成体化程度较低；而群居型海鞘如 Botryllus schlosseri 的幼虫则表现出高度成体化，具有开放的水管、穿孔的鳃裂甚至芽体。真海鞘（*Halocynthia roretzi*）是一种具有重要商业价值的独居型海鞘，在韩国和日本被大规模养殖以供食用。尽管其胚胎发生已被详细研究，且基因组信息相对清楚，但对于其幼虫的整体形态学，尤其是附着乳头（adhesive papillae）的精细结构，一直缺乏系统的描述。因此，本研究旨在通过三维重建、组织学和透射电子显微镜等手段，首次全面描述 H. roretzi 幼虫的解剖结构，并将其与 B. schlosseri 和 C. intestinalis 的幼虫进行比较，以探讨成体化程度的差异，同时重点关注附着乳头在附着过程中的动态变化。

在研究方法与流程上，本研究首先从日本东北大学浅虫海洋生物站附近采集 H. roretzi 成体，通过体外受精获得胚胎，并在13°C条件下培养35小时直至幼虫孵化。对47只幼虫进行了形态测量，测定了幼虫全长、躯干长和尾长，其中既包括乳头前伸的典型游动幼虫，也包括乳头缩短的附着初期幼虫。随后，研究对游动幼虫和附着幼虫分别进行了组织学与超微结构分析。样本经戊二醛和锇酸固定、梯度脱水后包埋于环氧树脂中，使用超薄切片机制备1微米厚的半薄切片并用甲苯胺蓝染色用于光学显微镜观察，同时制备80纳米厚的超薄切片并经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，在100 kV透射电子显微镜下观察乳头细胞的超微结构。为了获得幼虫整体三维形态，研究选取了一只游动幼虫进行连续横切，将约20张切片排成链状，对全部切片拍照后利用Adobe Photoshop CS进行图像对齐，并在Amira软件中完成除被囊外的所有器官的三维重建。此外，研究还将 H. roretzi 的三维重建结果与此前已有的 C. intestinalis 和 B. schlosseri 幼虫三维重建数据集进行了比较。在数据分析流程上，形态测量数据用于确定幼虫基本尺寸；组织学连续切片用于构建三维模型并明确各内部器官的相对位置；透射电子显微镜图像则用于鉴定乳头内不同细胞类型的超微结构特征及其在游动和附着两种状态下的变化。

研究结果显示，孵化后10小时的 H. roretzi 幼虫平均全长为1744 ± 18微米，其中尾部长度为1252 ± 15微米，躯干长度为490 ± 6微米。在躯干前端有三个附着乳头，按等边三角形的顶点排列。三维重建清晰地展示了幼虫内部器官的空间关系：口吸管原基覆盖在正在从躯干内胚层分化的咽原基上方；中枢神经系统位于内胚层背侧，在躯干内膨大形成感觉囊（sensory vesicle），其后为内脏神经节（visceral ganglion），两者之间由狭窄的颈部相连。感觉囊不对称，右侧更为膨大，内含两个色素感觉器官——眼点（ocellus）和耳石（otolith），其中耳石由单个巨大的色素细胞构成。在躯干后背侧，咽内胚层与正在发育的外胚层围鳃腔（peribranchial chambers）相接触，左右两个围鳃腔在背侧中枢神经系统上方汇合形成一个小腔，代表成体围心腔（atrial chamber）的原基。围心腔通过背侧躯干表面的一个浅凹——围心腔水管（atrial siphon）——与外界相通，但此时该开口仍被一薄层被囊覆盖，因此幼虫体内尚无海水循环。躯干后腹侧存在大量间充质细胞，脊索从尾部向前延伸至围心腔原基的后方。与 C. intestinalis 和 B. schlosseri 的三维重建比较发现，H. roretzi 的幼虫外部形态与 C. intestinalis 更相似，均为细长纺锤形，但两种柱鳃目（Stolidobranchia）物种——H. roretzi 和 *B. schlosseri*——均具有 C. intestinalis 所没有的成体化特征，即围心腔已形成明显的结构。不过与 H. roretzi 相比，B. schlosseri 的幼虫具有更高的成体化水平，表现为大型且已穿孔的咽和已分化的消化道。

关于附着乳头的超微结构，研究发现 H. roretzi 游动幼虫的乳头由三种细胞类型组成：轴柱细胞（axial columnar cells，ACCs）构成乳头核心，其远端具有指状突起，细胞核位于基底部，胞质富含不同电子密度的囊泡；领细胞（collocytes，CCs）环绕ACCs，胞质内充满大小不一的电子致密囊泡，远端具有大量微绒毛；初级感觉神经元（primary sensory neurons，PSNs）位于乳头外侧，呈纺锤形，其远端突起并不到达乳头尖端，而是止于更靠后的位置。与 C. intestinalis 不同，H. roretzi 的乳头尖端未观察到由内层被囊形成的透明帽。在附着幼虫中，乳头形态发生显著变化，形成中央凹槽，呈现杯状外观。ACCs变短，细胞核形态不规则；CCs构成凹槽壁；PSNs则延伸到乳头前缘，其纤毛具有非典型形态，并可见基体结构。这些变化表明 H. roretzi 的附着乳头并非简单的锥形结构，而是在附着过程中经历动态的重塑。

综合来看，本研究首次提供了 H. roretzi 幼虫的三维重建，证实了其幼虫具有“最小程度的成体化”（minimal adultation）：虽然整体解剖结构与 C. intestinalis 等简单幼虫相似，但已出现发育良好的围心腔和围心腔水管原基。这一发现修正了此前将 H. roretzi 幼虫简单等同于 Ciona 属或 Phallusia 属幼虫的观点。同时，该研究还表明 H. roretzi 的附着乳头在附着过程中发生动态形态变化，其复杂性超出了以往基于光学显微镜的描述，这对于理解海鞘附着乳头的形态演化以及幼虫底栖选择机制具有重要意义。从应用角度看，H. roretzi 作为重要的经济养殖物种，对其幼虫生物学的深入了解有助于解决养殖中的种群补充和附着基选择等实际问题。此外，该研究还展示了将连续切片三维重建与比较形态学分析相结合的方法在海洋无脊椎动物幼虫研究中的有效性。