本研究由Juqing Kang、Huiting Zhang、Tianshu Sun、Yihao Shi、Jianqiao Wang、Baocai Zhang、Zhiheng Wang、Yihua Zhou和Hongya Gu共同完成，作者单位包括北京大学蛋白质与植物基因研究国家重点实验室、中国科学院遗传与发育生物学研究所、北京大学城市与环境科学学院以及哥本哈根大学宏观生态学、进化与气候研究中心。该研究于2013年发表在《New Phytologist》期刊上（DOI: 10.1111/nph.12335），题为《Natural variation of C-repeat-binding factor (CBFs) genes is a major cause of divergence in freezing tolerance among a group of Arabidopsis thaliana populations along the Yangtze River in China》。

学术背景

本研究属于植物分子生态学与适应性进化领域，聚焦于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）在低温环境下的自然变异机制。温度是影响植物地理分布和作物农业范围的主要环境因素之一，而低温胁迫对大多数植物物种构成非生物胁迫。拟南芥广泛分布于不同气候条件的地区，其自然种群在冷响应上表现出显著变异，为研究适应性性状的自然变异提供了理想模型。此前研究表明，拟南芥的耐冻性与栖息地的最低温度或纬度高度相关，但针对单系起源自然种群的遗传、生化和分子基础的详细解析尚未见报道。

CBF（C-repeat-binding factor）途径是植物冷驯化的主要信号通路之一。CBF1、CBF2和CBF3（又称DREB1B、DREB1C和DREB1A）是一类快速响应低温的转录因子，通过激活下游CBF调节子（regulon）基因（如COR15A、RD29A等）调控耐冻性。然而，CBF基因家族在自然种群中的分化及其对低温适应的贡献机制尚不明确。本研究以长江流域四个单系起源的拟南芥自然种群为对象（推测约9万年前从共同祖先分化），旨在解决三个核心问题：（1）这些种群在耐冻性上是否已分化；（2）分化的生化与分子机制；（3）分化是否具有适应性意义。

研究流程与方法

1. 实验材料与耐冻性测定

研究选取长江流域四个拟南芥自然种群：重庆铜梁（CQTLX）、江西九江（JXJJS）、安徽潜山（AHQSX）和陕西城固（SXCGX），其栖息地1月平均温度依次降低（6.7°C至1.0°C）。通过冷冻耐受性实验（-6°C和-8°C处理）测定冷驯化（CA）与非驯化（NCA）条件下的存活率。每种群至少3个重复，每重复25-30株。实验采用渐进降温法（1°C/h），统计保持两片以上新生莲座叶绿化的植株比例。

2. 基因表达与代谢分析

通过实时定量PCR（qRT-PCR）分析冷处理（4°C）后0.25 h至7天内CBF1-3及其下游基因（如COR15A、RD29A、AtGOLS3）的表达动态。以翻译延伸因子EF1α为内参，每个时间点至少3次重复。同时，基于已有微阵列数据（He et al., 2008），通过基因集富集分析（GSEA）筛选与耐冻性相关的代谢通路，重点检测棉子糖家族寡糖（RFOs）合成通路中半乳糖醇（galactinol）和棉子糖（raffinose）的含量（气相色谱-质谱法）。

3. 数量性状位点（QTL）定位

构建耐冻性最高（SXCGX）与最低（CQTLX）种群的F2群体（320株），利用78个个体和58个插入/缺失（InDel）标记进行基因分型。通过MapManager QTX17软件构建遗传连锁图谱，采用区间作图法定位调控AtGOLS3表达差异的QTL。

4. CBF基因功能验证

克隆CQTLX和SXCGX的CBF1-3编码区，构建酵母表达载体（pYF503融合GAL4 DNA结合域），通过β-半乳糖苷酶滤膜和液相实验（ONPG底物）检测转录激活活性。截断实验进一步验证CBF2功能域的重要性。

主要结果

1. 耐冻性分化与栖息地温度负相关
   SXCGX（低温栖息地）在-6°C（CA）下存活率最高（79.1%），显著高于CQTLX（37.6%），且与1月平均温度呈显著负相关（Pearson r = -0.999, p < 0.01）。

2. CBF基因自然变异驱动表达差异

   • CBF3：长江种群启动子区存在1725 bp片段替换（含转座片段），导致其冷诱导表达水平显著低于哥伦比亚生态型（Col）。
     
   • CBF2：除SXCGX外，其他种群在转录激活域存在单碱基（A）插入，导致移码和蛋白功能丧失。酵母实验证实仅SXCGX的CBF2保留转录激活能力（p < 0.001）。
     

3. 代谢通路与QTL定位
   RFOs通路基因（如AtGOLS3）在SXCGX中表达更高，其产物半乳糖醇和棉子糖含量与耐冻性正相关（p < 0.05）。QTL分析定位到两个显著位点：

   • qDEPL1（染色体4，CBF1-3所在区间）解释30%表达变异（LOD=6.50）；
     
   • qDEPL2（染色体5）解释12%变异。
     

结论与意义

本研究首次揭示长江流域拟南芥单系种群的耐冻性分化由CBF基因自然选择驱动：
1. 适应性进化机制：SXCGX保留功能性CBF2，可能源于其低温栖息地的强选择压力；而其他种群因CBF3启动子变异和CBF2功能丧失，耐冻性降低。
2. 科学价值：为植物局部适应提供分子证据，阐明CBF家族在短期（9万年）进化中的分化模式。
3. 应用潜力：为作物耐寒育种提供靶点（如优化CBF2等位基因）。

研究亮点

1. 创新性发现：首次将CBF2功能变异与自然种群耐冻性梯度关联，提出“CBF3功能丧失后CBF2代偿”的适应性假说。
   
2. 方法学贡献：整合QTL定位、酵母功能互补和代谢组学，多维度验证基因型-表型关联。
   
3. 样本特殊性：聚焦东亚拟南芥种群，填补全球自然变异研究的区域空白。
   

其他价值

研究暗示约9万年前的气候变暖可能通过放松选择压力促使CBF3变异固定，为古气候-植物协同进化研究提供线索。