本文报道了一项关于桃（Prunus persica）类黄酮醇（flavonol）生物合成过程中糖基化与甲基化修饰机制的原创性研究成果。该研究由Xie, Linfeng、Guo, Yan、Ren, Chuanhong、Cao, Yunlin、Li, Jiajia、Lin, Jing、Grierson, Donald、Zhao, Xiaoyong、Zhang, Bo、Sun, Chongde、Chen, Kunsong和Li, Xian共同完成，主要研究单位包括浙江大学山东省（临沂）现代农业研究院、浙江省园艺植物整合生物学重点实验室（浙江大学）以及英国诺丁汉大学生物科学学院植物与作物科学学部。该研究于2022年3月5日正式接受，最终发表于国际期刊《Plant, Cell & Environment》（PCE），文章DOI为10.1111/pce.14323，标题为“Unravelling the consecutive glycosylation and methylation of flavonols in peach in response to UV‐B irradiation”。
二、 学术背景 本研究的核心科学领域是植物次生代谢，具体聚焦于类黄酮化合物的生物合成与修饰途径。类黄酮醇糖苷是植物中普遍存在的一类黄酮类化合物，在植物抵御环境胁迫（尤其是UV-B辐射）以及人类营养健康方面扮演着重要角色。其结构多样性主要源于糖基化和甲基化等修饰反应。桃的花和果实中富含多种类黄酮醇糖苷，如山柰酚-3-O-芸香糖苷（isorhamnetin 3‐o‐rutinoside， I3Rut）、槲皮素-3-O-芸香糖苷（quercetin 3‐o‐rutinoside， Q3Rut）等。UV-B辐射已被证实能显著诱导多种植物类黄酮醇的积累，为研究其生物合成关键基因提供了有效的诱导条件。
尽管对负责类黄酮醇苷元形成初级单糖苷的尿苷二磷酸-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases， UGTs）研究较多，但对于催化形成二糖苷（如芸香糖苷）的分支形成糖基转移酶（branch-forming GTs）的研究则相对有限。同样，类黄酮O-甲基转移酶（O-methyltransferases， OMTs）在类黄酮醇甲基化中的作用，特别是糖基化与甲基化反应的发生顺序，尚不清楚。因此，本研究旨在：1）阐明UV-B辐射如何诱导桃果实中类黄酮醇糖苷的积累；2）鉴定并功能验证参与桃类黄酮醇连续糖基化（形成单糖苷和二糖苷）和甲基化的关键UGT和OMT基因；3）揭示I3Rut等复杂类黄酮醇糖苷的生物合成途径与顺序，为未来通过代谢工程改造类黄酮醇提供理论基础。
三、 详细研究流程 研究流程系统且严谨，主要包括以下几个部分： 1. 植物材料与处理： 研究选用桃品种‘湖景蜜露’。采集了四个发育阶段（S1快速生长期、S2硬核期、S3二次快速生长期、S4成熟期）的果实、花期花朵以及幼嫩叶片。为研究UV-B响应，在果实硬核期后用黑袋套袋，于二次快速生长期（94天）摘取约200个均匀果实，分为两组置于人工气候室。实验组接受UV-B辐射（280–315 nm， 50 μW cm−2），对照组置于黑暗条件。分别在处理0、48、96和192小时后取样果皮，液氮速冻后储存于-80°C备用。每个时间点设置三个生物学重复，每个重复包含4个果实。 2. 代谢物分析： 采用高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对桃不同组织及UV-B处理后果皮中的类黄酮醇糖苷进行定性与定量分析。样品经50%甲醇超声提取，离心取上清液进行HPLC-PDA分析，检测波长为370 nm。利用LC-MS/MS通过比对保留时间、紫外吸收光谱、母离子及特征碎片离子信息，并与标准品对比，最终鉴定出13种类黄酮醇糖苷，包括Q3Rut、槲皮素-3-O-半乳糖苷（Q3Gal）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3Glc）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（K3Rut）、山柰酚-3-O-半乳糖苷（K3Gal）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（K3Glc）、I3Rut、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（I3Glc）及其异构体等。使用标准曲线对各化合物进行定量。 3. 候选基因筛选与系统发育分析： 利用已知的植物次生产物糖基化转移酶保守序列（PSPG box）和已有的桃基因组、转录组（RNA-seq）数据（包括不同组织、发育阶段及UV-B处理数据），通过BLASTP比对和表达谱相关性分析，筛选出三个候选UGT基因：PpUGT78T3、PpUGT78A2和PpUGT91AK6。同时，通过基因组搜索和保守结构域分析获得82个假定OMT基因，将其与已知功能的植物OMT进行系统发育分析，筛选出属于CCoAOMT亚家族中PFOMT（类黄酮OMT）亚组的PpFOMT1作为候选OMT基因。系统发育树利用MEGA 7软件构建。 4. 基因表达分析： 采用CTAB法提取总RNA，反转录为cDNA后进行定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）。以PpTEF2作为内参基因，分析上述四个候选基因在桃不同组织（叶、花、果实发育各阶段）以及UV-B处理不同时间点的表达模式。 5. 重组蛋白表达与纯化： 将四个候选基因的编码序列克隆至pET32a(+)表达载体，在E. coli BL21（DE3）pLysS中诱导表达带His标签的重组蛋白。使用组氨酸亲和层析柱纯化蛋白，并通过BCA法进行蛋白定量。 6. 体外酶活测定： 在体外反应体系中，分别以UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-鼠李糖（UDP-Rha）为糖供体，以类黄酮醇苷元（槲皮素、山柰酚、异鼠李素）或其糖苷（如Q3Glc、K3Glc、I3Glc）为糖受体，或以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，测试纯化的重组蛋白的催化活性。反应产物通过HPLC和LC-MS/MS鉴定。研究还测定了各酶的最适pH、最适温度、底物特异性（测试了包括黄烷醇、黄酮、二氢黄酮、异黄酮在内的多种黄酮类化合物），并通过商业试剂盒测定了酶促动力学参数（Km， Vmax， kcat/Km）。 7. 瞬时表达验证： 为了在植物体内验证基因功能，将四个候选基因的全长编码序列分别构建到pGreenII 0029 62-SK载体上，获得由35S启动子驱动的超表达载体。通过农杆菌介导的瞬时转化法，将这些载体单独或与已知的桃类黄酮醇特异性转录因子基因PpMYB15共同注射到本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中。转化后第5天收集叶片，提取代谢物，利用LC-MS/MS分析烟草叶片中类黄酮醇谱的变化，以空载体注射作为对照。
四、 主要研究结果 1. 桃中类黄酮醇糖苷的分布与UV-B诱导效应： LC-MS/MS分析成功鉴定出13种类黄酮醇糖苷。在幼果果皮中，I3Rut、K3Rut、I3Glc和K3Glc是主要成分，而Q衍生物含量较低。成熟果实中总类黄酮醇含量下降。花朵中总含量极高，达3310.8 μg/g FW，其中K3Rha含量丰富。叶片中则以K3Glc、Q3Glc等单糖苷为主。UV-B照射后，所有检测的类黄酮醇单糖苷（Q3Glc， Q3Gal， K3Glc， I3Glc）和二糖苷（I3Rut， Q3Rut， K3Rut）含量均被显著诱导增加，尤其是处理192小时后，Q3Gal和Q3Glc含量分别增加了18倍和7倍。这证实UV-B是研究桃类黄酮醇生物合成调控的有效手段。 2. 候选基因的表达模式： qRT-PCR结果显示，四个候选基因在类黄酮醇含量高的组织（如幼果S1期、花朵）中表达量较高，表明其表达与代谢物积累相关。在UV-B处理下，PpUGT78T3和PpUGT78A2的表达被显著且持续诱导，PpUGT91AK6在处理后期（192h）表达上调，而PpFOMT1的表达水平整体较低但存在。表达谱与UV-B诱导的代谢物积累趋势基本吻合，支持了这些基因参与UV-B响应的类黄酮醇生物合成的假设。 3. 重组蛋白的体外酶学功能鉴定： * PpUGT78T3： 被鉴定为类黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶。它能以UDP-Glc为供体，高效地将槲皮素、山柰酚、异鼠李素分别转化为Q3Glc、K3Glc和I3Glc。它对槲皮素的亲和力最高（Km最低），催化效率也最高。此外，它对柚皮素也有微弱的葡萄糖基化活性，但对其他糖供体（UDP-Gal， UDP-Rha）活性很低。 * PpUGT78A2： 被鉴定为类黄酮醇3-O-半乳糖基转移酶。它特异地以UDP-Gal为供体，催化槲皮素、山柰酚、异鼠李素形成相应的3-O-半乳糖苷（Q3Gal， K3Gal， I3Gal），不能利用UDP-Glc或UDP-Rha。对槲皮素的催化效率最高。 * PpUGT91AK6： 被鉴定为类黄酮醇1，6-鼠李糖基转移酶。它特异性地以UDP-Rha为供体，催化类黄酮醇3-O-葡萄糖苷（Q3Glc， K3Glc， I3Glc）的6位羟基鼠李糖基化，形成相应的芸香糖苷（Q3Rut， K3Rut， I3Rut）。它也能催化Q3Gal的鼠李糖基化。该酶不能利用类黄酮醇苷元作为底物，说明它专一地负责第二步糖基化（分支形成）。 * PpFOMT1： 被鉴定为类黄酮醇O-甲基转移酶。它能以SAM为供体，催化槲皮素、Q3Glc、Q3Rut的3‘-OH甲基化，分别生成异鼠李素、I3Glc和I3Rut。对槲皮素底物的亲和力极高（Km值非常低，0.88 μM）。 4. 瞬时共表达验证体内功能： 在本氏烟草叶片中，单独表达PpMYB15可激活内源类黄酮醇合成途径，产生Q3Rut等产物。 * 共表达PpMYB15和PpUGT78T3，导致烟草叶片中Q3Glc的大量积累，同时Q3Rut和K3Rut含量也显著增加。 * 共表达PpMYB15和PpUGT78A2，导致Q3Gal大量积累，并意外地产生了两种新的化合物，质谱推断为以半乳糖为内核的类芸香糖苷（Q-rhamnosyl galactoside， QGR和K-rhamnosyl galactoside， KGR），这表明PpUGT78A2的产物可被烟草内源的鼠李糖基转移酶进一步修饰。 * 共表达PpMYB15和PpUGT91AK6，显著提高了Q3Rut的积累量。 * 共表达PpMYB15和PpFOMT1，导致在野生型烟草中原本不存在的I3Rut大量生成，同时Q3Rut含量下降。 这些体内结果完美验证了体外酶活测定的底物特异性，并证明这些基因在异源系统中具有功能活性，能够重建或改变类黄酮醇的修饰图谱。
五、 结论与意义 本研究系统性地解析了桃响应UV-B辐射时类黄酮醇的连续糖基化与甲基化机制，并成功鉴定并功能验证了四个关键酶： 1. PpUGT78T3：负责类黄酮醇3-O-葡萄糖基化。 2. PpUGT78A2：负责类黄酮醇3-O-半乳糖基化。 3. PpUGT91AK6：负责类黄酮醇3-O-葡萄糖苷的1，6-鼠李糖基化，形成芸香糖苷（二糖苷）。 4. PpFOMT1：负责槲皮素及其糖苷的3‘-O-甲基化，生成异鼠李素衍生物。
科学价值： 该研究不仅鉴定了桃中负责类黄酮醇单糖苷合成的UGT，更重要的是鉴定了一个参与类黄酮醇二糖苷（芸香糖苷）形成的分支形成糖基转移酶（PpUGT91AK6），拓展了对植物类黄酮醇糖基化复杂网络的认识。同时，明确了PpFOMT1作为PFOMT亚类成员，在桃类黄酮醇甲基化中的关键作用。基于酶动力学数据（PpFOMT1对槲皮素底物的极高亲和力），研究者提出了I3Rut最可能的生物合成途径顺序为：先进行糖基化（形成Q3Glc），再进行鼠李糖基化（形成Q3Rut），最后进行甲基化（形成I3Rut）。这一研究为理解类黄酮修饰反应的顺序提供了新的见解。
应用价值： 研究成果具有明确的代谢工程应用潜力。通过异源表达这些关键基因，可以在模式植物（如烟草）或作物中定向改造类黄酮醇的组成，例如生产高价值的异鼠李素衍生物（如I3Rut，其具有报道的抗癌和心脑血管保护活性）。这为开发具有特定保健功能的农产品或通过合成生物学手段生产类黄酮醇化合物提供了关键的基因资源和理论指导。
六、 研究亮点 1. 研究对象的特色性： 以桃为主要材料，聚焦于其富含的、具有特色结构的类黄酮醇糖苷（特别是I3Rut），为解析特定园艺作物中类黄酮代谢的种属特异性提供了范例。 2. 基因功能鉴定的完整性： 研究结合了生物信息学筛选、表达谱分析、体外酶学特性详细表征（包括动力学参数）以及植物体内瞬时表达验证，形成了完整的功能基因鉴定证据链，结论坚实可靠。 3. 发现了新颖的分支形成糖基转移酶： PpUGT91AK6作为一个新的1，6-鼠李糖基转移酶被鉴定，其在系统发育树上不与已知的同类酶聚集，暗示了UGT家族在进化上的复杂性，为研究糖基转移酶的功能分化提供了新案例。 4. 阐明了修饰顺序的线索： 通过比较不同酶对糖基化和甲基化底物的动力学参数，为推断自然条件下类黄酮醇修饰的可能顺序提供了实验依据，推动了从静态的“酶功能鉴定”向动态的“途径解析”发展。
七、 其他有价值内容 本研究还展示了UV-B辐射对不同B环羟基化程度的类黄酮醇诱导程度的差异：双羟基B环的槲皮素衍生物（Q3Glc， Q3Gal， Q3Rut）的诱导倍数普遍高于单羟基B环的山柰酚衍生物（K3Glc， K3Rut），这提示在UV-B胁迫下，具有更强抗氧化活性的槲皮素类物质的合成可能被优先强化，反映了植物次生代谢响应环境胁迫的功能适应性。
此外，在瞬时表达实验中，PpUGT78A2的共表达导致了推测的“半乳糖-鼠李糖”二糖苷（QGR， KGR）的产生，这是一个有趣的现象，表明异源系统中可能存在“底物驱动”的杂合途径，也提示了在不同植物物种中，类黄酮醇二糖苷的核心糖单元可能存在多样性（葡萄糖或半乳糖），这值得进一步探索。