本文作者为Erika Szabó、István Venekei、Zsolt Böcskei、Gábor Náray-Szabó和László Gráf，分别来自匈牙利科学院Eötvös Loránd大学生物化学系、农业生物技术中心、蛋白质建模研究组以及生物技术研究组。该研究于2003年发表于*Journal of Molecular Biology*，题为“Three dimensional structures of S189D chymotrypsin and D189S trypsin mutants: the effect of polarity at site 189 on a protease-specific stabilization of the substrate-binding site”。

本研究属于结构生物学与酶学领域，重点关注胰蛋白酶（trypsin）和糜蛋白酶（chymotrypsin）的底物特异性决定机制。这两种丝氨酸蛋白酶在三维结构上高度相似，共享相同的催化三联体（catalytic triad）His57、Asp102和Ser195，但对底物P1位氨基酸残基表现出显著不同的选择性。传统模型认为，189位氨基酸残基的极性差异是决定S1特异性口袋（specificity site）底物偏好的关键：胰蛋白酶中的Asp189提供负电荷以稳定带正电的Lys或Arg底物，而糜蛋白酶中的Ser189则偏好疏水性芳香族残基。然而，此前的定点突变实验表明，仅将189位残基互换并不能实现底物特异性的相互转换，突变体D189S胰蛋白酶和S189D糜蛋白酶均表现出活性下降四到六个数量级、选择性下降两到四个数量级的严重功能缺陷。这一现象提示，底物特异性的决定可能涉及更复杂的结构重排，而不仅仅是单一位点的电荷性质改变。因此，本文旨在通过解析未结合抑制剂的游离突变体晶体结构，揭示S189D糜蛋白酶和D189S胰蛋白酶在活性位点区域的结构变化，并解释这些变化如何导致催化活性和选择性的丧失。

研究的核心实验流程包括突变体表达、纯化、结晶、X射线衍射数据收集与结构解析以及后续的结构比较与建模分析。作者首先利用酵母表达系统制备了大鼠S189D糜蛋白酶原和D189S胰蛋白酶原。在激活前，通过苯基琼脂糖凝胶（phenyl-Sepharose）疏水层析进一步纯化酶原。S189D糜蛋白酶原在表达时含有大鼠胰蛋白酶原前肽以及Cys122Ser替换，因而在肠激酶（enterokinase）切割Lys15-Ile16键后，前肽能够解离，不形成野生型糜蛋白酶中Cys1-Cys122二硫键连接的前肽结构。激活后的活性酶通过大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）琼脂糖柱纯化。S189D糜蛋白酶采用悬滴气相扩散法在室温下结晶，结晶条件包含1 mM HCl、10 mM CaCl₂、0.1 M HEPES（pH 7.0）、34%（w/v）PEG MME 2000和0.1 M硫酸铵。X射线衍射数据在Rigaku RAXIS II成像板上收集，使用Rigaku RU200发生器产生CuKα辐射。数据处理使用MOSFLM和SCALA程序完成，结构通过分子替换法求解，搜索模型为牛α-糜蛋白酶（PDB编号2CHA），但根据物种差异和突变位点进行了修饰。模型构建使用O程序，精修使用XPLOR 3.581，并用PROCHECK进行结构验证。最终S189D糜蛋白酶结构的空间群为C2221，分辨率为2.55 Å，R因子为21.68%，自由R因子为27.49%。D189S胰蛋白酶的结构此前已由同一团队解析并发表（PDB编号1AMH）。结构比较分析主要通过将突变体与野生型活性酶及酶原模型进行叠加，比较关键区域主链和侧链的位移、二硫键位置、氢键网络以及底物结合口袋的几何特征。

结构分析结果显示，两个突变体虽然整体结构稳定，但在激活域（activation domain）内，尤其是底物结合区域，出现了大量严重的构象变形，且S189D糜蛋白酶的变形程度大于D189S胰蛋白酶。主要变形集中在S1特异性位点附近的两个表面环：C2/D2环（残基185–195）和E2/F2环（残基217–224）。在S189D糜蛋白酶中，Cys191-Cys220二硫键相对野生型移动了2.6–7.9 Å，两个半胱氨酸残基均发生位移；而在D189S胰蛋白酶中，Cys191保持野生型位置，但Cys220发生转位和χ1角旋转。二硫键的大幅移动导致S1特异性口袋的中部三分之一变宽并暴露于溶剂，而下部三分之一（围绕189位）则因残基216–220的移位而被堵塞。在D189S胰蛋白酶中，Ser189保留在野生型酶中该位点的位置和构象；而在S189D糜蛋白酶中，Asp189侧链因主链大幅位移而转向分子表面，完全暴露于溶剂，距离底物结合所需位置6.2 Å。此外，S189D糜蛋白酶中缺失了Asp194侧链羧基与N端Ile16 α-氨基之间的盐桥，这是所有活性形式胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶中保守存在的相互作用。Asp194侧链采取类似糜蛋白酶原的构象，Gly193也偏离形成氧阴离子洞（oxyanion hole）所需的位置超过4 Å，因此氧阴离子洞不复存在。相比之下，D189S胰蛋白酶中的Asp194-Ile16盐桥保持完整，氧阴离子洞也未受破坏。S189D糜蛋白酶还在N端Ile16-Gly19区域出现显著位移，其中Val17偏离野生型位置8.0 Å，Ile16因电子密度缺失而不可见；Gly19的φ角旋转约100°。此外，S189D糜蛋白酶的75–79位表面环（D1/E1环）发生2–6 Å位移，并在此处结合了一个钙离子，这一现象此前仅在胰蛋白酶结构中观察到。D189S胰蛋白酶则在自溶环（autolysis loop，残基145–149）出现重排，该结果已在早期论文中讨论。

这些结果表明，两个突变体均无法采用野生型底物结合模式。S1口袋中部的加宽和溶剂暴露使得P1残基中部缺乏来自Cys191-Cys220二硫键及主链原子190O–192Cα和214O–221N的范德华支撑；同时，S189D糜蛋白酶中主链原子217N–218N以及D189S胰蛋白酶中219位残基造成空间位阻，阻碍底物充分深入口袋底部。对于带正电的胰蛋白酶底物（P1 Lys或Arg），两个突变体均无法提供足够的氢键伴侣和负静电势，因为D189S胰蛋白酶中Asp189被Ser取代且结构水分子发生重排，而S189D糜蛋白酶中Asp189侧链转向溶剂。这些结构缺陷共同解释了突变体酶活性和选择性的大幅下降。

本研究的核心结论是：丝氨酸蛋白酶S1特异性位点的极性稳定依赖于C2/D2环和E2/F2环所构成的复杂相互作用网络。Asp189的侧链羧基在胰蛋白酶中不仅提供负电荷以识别底物，还作为C2/D2环与E2/F2环之间以及S1位点两壁之间的结构桥接组分，其移除会破坏整个局部构象。同时，在疏水性环境中埋藏一个可电离基团需要精细的极性相互作用网络进行能量补偿，糜蛋白酶原有的网络不足以稳定Asp189，因此该侧链被迫翻转到溶剂中。这一发现解释了为何仅改变189位残基不能实现特异性转换，也解释了此前需要替换15个氨基酸残基才能实现胰蛋白酶向糜蛋白酶特异性转换的原因。该研究的重要价值在于从结构层面阐明了丝氨酸蛋白酶底物特异性不仅由单一位点的化学性质决定，还依赖于局部环区构象和相互作用网络对S1位点极性的精确稳定，为理解酶特异性演化以及理性设计酶突变体提供了新的结构基础。研究的亮点在于首次解析了未结合底物或抑制剂的S189D糜蛋白酶晶体结构，并将其与D189S胰蛋白酶及野生型酶和酶原进行了系统比较，揭示了单点突变导致的大范围构象重排及其对活性位点完整性的深远影响。