本研究由Qingtao Sun、Xiangning Li、Miao Ren等学者共同完成，主要作者还包括Minmin Luo、Hui Gong和Qingming Luo，通讯作者为Qingming Luo。研究机构包括华中科技大学武汉光电国家研究中心Britton Chance生物医学光子学中心、华中科技大学工程科学学院生物医学光子学教育部重点实验室、华中科技大学苏州脑空间信息研究院、北京生命科学研究所，以及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心。该论文于2019年发表在 Nature Neuroscience 上，题为“A whole-brain map of long-range inputs to GABAergic interneurons in the mouse medial prefrontal cortex”。
这项研究属于神经科学领域中的神经环路示踪与全脑连接组学研究。内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）中的γ-氨基丁酸能（GABAergic）中间神经元在调节工作记忆、决策以及情感方面发挥重要作用，其功能障碍与重度抑郁症、精神分裂症和癫痫等疾病密切相关。mPFC中的GABAergic神经元包括表达小清蛋白（parvalbumin, PV+）、表达生长抑素（somatostatin, SST+）以及表达血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP+）的三种主要亚型，它们各自在神经环路和行为层面具有不同功能。然而，此前对于这些中间神经元亚型在全脑范围内接收的直接长程突触输入了解并不充分。传统化学示踪或腺相关病毒示踪无法区分特定神经元类型的输入，局部配对记录只能解析局部环路，光遗传辅助环路示踪虽能验证特定类型的长程连接，但难以同时分析多个脑区之间的连接。因此，本研究旨在利用改良狂犬病毒单突触示踪结合荧光显微光学切片断层成像系统（fluorescence micro-optical sectioning tomography, fMOST），绘制小鼠mPFC中PV+、SST+和VIP+神经元在全脑范围内的直接长程输入图谱，并进一步解析输入神经元的神经化学特性和单神经元形态，以期为理解前额叶皮层的结构和功能组织提供解剖学基础。
在工作流程上，研究首先通过立体定位注射将Cre依赖的辅助病毒AAV-DIO-TVA-mCherry和AAV-DIO-RG注入PV-Cre、SST-Cre和VIP-Cre小鼠的mPFC前边缘区（prelimbic, PL）或下边缘区（infralimbic, ILA）。其中TVA是禽类白血病病毒受体，可使包膜为EnvA的狂犬病毒进入Cre阳性神经元；RG则提供狂犬病毒跨突触传播所需的糖蛋白。三到四周后，在同一注射位点注入重组狂犬病毒SAD-ΔG-GFP(EnvA)-RV。通过这种方式，初始感染细胞表达GFP和mCherry成为起始细胞，狂犬病毒可逆行跨越一个突触标记直接输入神经元。注射十天后取材，观察到大量GFP标记神经元和双色标记的起始细胞。为验证示踪特异性，研究者进行了免疫组化染色，发现绝大多数mCherry阳性神经元确实是PV+或SST+神经元；在野生型小鼠或仅注射狂犬病毒的对照实验中，注射位点外几乎没有神经元被标记。随后利用fMOST系统以0.32×0.32×2 µm³的分辨率对病毒标记的全脑样本进行成像，并将原始数据配准到Allen小鼠脑通用坐标框架（Common Coordinate Framework, CCF）v3.0，从而获得全脑输入神经元的分布和单神经元形态。样本量方面，SST-Cre组共18只小鼠，PV-Cre组共14只，VIP-Cre组共10只用于长程输入分析；另有部分小鼠用于免疫组化、电生理和单神经元重建实验。
在结果部分，研究发现PV+、SST+和VIP+神经元在PL和ILA两个亚区接收来自相似脑区的输入，但不同亚型和亚区之间存在定量差异。通过双色狂犬病毒标记和霍乱毒素亚单位B逆行示踪，证实PL和ILA即使在同一脑区内也主要由不同的上游神经元支配。皮层是最大的输入来源，其中边缘皮层含有最多的皮层输入神经元；皮层输入神经元在无颗粒型皮层（如边缘皮层、运动皮层和联合皮层）主要分布在II/III层，而在感觉皮层等颗粒型皮层中主要分布在V层。SST+神经元相比PV+神经元接收更多来自皮层下核团的输入，尤其是来自外侧隔核、斜角带核、下丘脑外侧区和海马CA1区的输入，提示SST+神经元在海马-前额叶环路中扮演关键角色。PV+神经元接收更多来自扣带皮层的输入，而VIP+神经元则接收更多来自外侧眶额皮层的输入，这暗示PV+和VIP+神经元可能分别参与认知和感觉接收功能。
在神经化学特征方面，基底前脑中的胆碱能神经元、PV+神经元以及中缝核中的血清素能神经元均可直接支配mPFC中三类GABAergic神经元。约30-40%的基底前脑输入神经元为胆碱能阳性，其中超过80%的胆碱能神经元同时表达谷氨酸转运体EAAC1；中缝核中约一半的输入神经元为血清素能阳性，其中超过70%同时表达EAAC1。通过光遗传辅助环路示踪与全细胞膜片钳记录，研究进一步证明基底前脑胆碱能神经元可以释放乙酰胆碱，并且部分胆碱能神经元和中缝核血清素能神经元还能释放谷氨酸，直接激活mPFC中的GABAergic神经元。此外，腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）中只有约5%的输入神经元为多巴胺能神经元，且未发现多巴胺能VTA神经元直接投射至SST+神经元。
研究还发现了多个新的神经环路。通过在SI和丘脑前内侧核（anteromedial thalamic nucleus, AM）中进行单突触逆行示踪、细胞类型特异性输入输出关系示踪技术（CTRIO）以及单神经元形态重建，发现SI中存在三类投射神经元，其中约18%的SI神经元可同时直接支配mPFC和与mPFC有联系的AM神经元，且这些SI神经元中约70%为非胆碱能神经元。此外，AM中投射至mPFC的神经元还接受来自背侧纹状体的直接输入，从而揭示了“mPFC-背侧纹状体-AM-mPFC”的超直接通路。
在皮层输入神经元的形态分类方面，研究重建了86个皮层输入神经元，并根据轴突和树突的投射模式将其分为七种类型，包括位于II/III层的胼胝体锥体神经元、V层的胼胝体锥体神经元、联合型锥体神经元、皮层-非脊髓投射锥体神经元、皮层脊髓投射锥体神经元、星状细胞以及VI层胼胝体神经元。这些不同类型在树突分支数量、顶树突长度和轴突侧支投射上存在显著差异。其中皮层脊髓投射锥体神经元仅在PV-Cre和SST-Cre小鼠的特定输入中被观察到。海马锥体神经元方面，研究重建了33个海马锥体神经元，发现投射至mPFC不同GABAergic神经元的海马锥体神经元具有不同的轴突侧支投射偏好：投射至SST+神经元的海马锥体神经元更倾向于同时投射至对侧CA1，而投射至PV+神经元的海马锥体神经元更倾向于同时投射至伏隔核。通过双色狂犬病毒标记实验进一步证实了这一投射偏好。
本研究的科学价值在于提供了首个综合性的全脑尺度小鼠mPFC不同GABAergic中间神经元亚型长程输入图谱，不仅包含输入神经元的分布，还包括其神经化学特性和单神经元形态信息。该图谱为理解前额叶皮层中不同GABAergic神经元的功能差异提供了解剖学基础，并可能为mPFC功能障碍相关的精神疾病治疗提供新线索。研究的方法学创新在于将Cre依赖的单突触狂犬病毒示踪与fMOST高通量全脑成像和自动配准技术相结合，实现了对输入神经元的全脑分布和单神经元投射组的精细表征。研究亮点包括：系统比较了PV+、SST+和VIP+三种中间神经元在PL和ILA区的输入差异；发现基底前脑胆碱能神经元和中缝核血清素能神经元与mPFC GABAergic神经元之间的谷氨酸共释放；揭示了SI-AM-mPFC和背侧纹状体-AM-mPFC等新的神经环路；基于单神经元形态对皮层和海马输入神经元进行了分类。研究的局限性主要包括双辅助病毒系统可能导致起始细胞数量被高估、原始TVA受体可能引起起始细胞扩散、以及少量起始细胞未严格限定在目标细胞类型中，但对照实验表明长程输入标记仍具有细胞类型特异性，结论稳健。