该文档是一份发表于基因（Gene） 期刊（2016年，第585卷）的原创性研究论文，由南京师范大学江苏省生物多样性与生物技术重点实验室的Ming Sang, Chengjun Li, Wei Wu 和通讯作者 Bin Li 完成。研究聚焦于赤拟谷盗（*Tribolium castaneum*）中两个胰岛素受体基因的鉴定、进化与功能分析。
第一部分：研究背景与目标
本研究隶属于昆虫内分泌学与发育生物学领域，核心是探究胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（Insulin and Insulin-like growth factor Signaling, IIS）在昆虫生长发育与繁殖中的调控机制。IIS通路在从哺乳动物到无脊椎动物的广泛生物中高度保守，负责协调生长、代谢、寿命和繁殖等多种关键生理功能。胰岛素受体是IIS通路的第一环，其活化开启下游级联信号传导。
先前研究表明，脊椎动物的胰岛素受体经历了至少两次复制，形成了胰岛素受体（IR）、胰岛素样生长因子受体（IGFR）和胰岛素受体相关受体（IRR）三个功能分化的亚类。相比之下，在大多数已研究的昆虫模型（如果蝇、埃及伊蚊、家蚕）中，仅发现一个胰岛素受体基因。然而，最近在社会性昆虫（如蜜蜂、火蚁）和部分半翅目昆虫（如褐飞虱）中发现了两个胰岛素受体，暗示在特定昆虫类群中可能存在基因复制与功能分化现象。赤拟谷盗作为一种新兴的鞘翅目昆虫模型，其基因组注释也提示存在两个胰岛素受体基因，但其中只有一个（TC010784）的功能曾被初步研究，另一个（TC007370）的功能以及两者之间的异同尚不清楚。
基于此背景，本研究设定了明确目标：1）从赤拟谷盗中克隆并鉴定这两个推测的胰岛素受体基因；2）通过系统进化分析探究其在昆虫乃至后生动物中的演化历史；3）分析它们在赤拟谷盗不同发育阶段的表达模式；4）利用RNA干扰技术分别敲低两个基因，系统评估它们对赤拟谷盗发育和繁殖的特定功能；5）初步探索这两个受体可能参与的下游信号通路。这项研究旨在深入理解昆虫胰岛素受体的进化规律，并阐明在非社会性昆虫中，胰岛素受体复制后产生的两个旁系同源基因是否以及如何实现了功能的歧化。
第二部分：详细研究方法与流程
本研究采用了经典的分子生物学、生物信息学和功能遗传学相结合的研究路线，流程清晰，层层递进。
流程一：基因鉴定与克隆。 首先，研究团队利用已知的黑腹果蝇胰岛素受体蛋白序列（AAF55903.2）作为查询序列，在赤拟谷盗基因组数据库（BeetleBase）中进行同源性搜索，初步鉴定出两个候选基因，命名为Tcas-IR1和Tcas-IR2。随后，根据预测的序列设计引物，以赤拟谷盗成虫总RNA反转录的cDNA为模板，通过PCR和3’-RACE技术，成功克隆了两个基因的全长cDNA序列。Tcas-IR1的开放阅读框为4092 bp，包含13个内含子；Tcas-IR2的开放阅读框为4170 bp，包含5个内含子。基因结构分析显示，Tcas-IR1位于X染色体，Tcas-IR2位于4号染色体。使用I-TASSER软件对两个受体蛋白的三维结构进行预测，结果显示它们均包含典型的α亚基（含有L1、CR、L2等配体结合结构域）和β亚基（含有三个纤连蛋白III型结构域、跨膜结构域和酪氨酸激酶催化结构域），形成与已知昆虫胰岛素受体相似的倒“V”形跨膜结构。
流程二：系统进化分析。 为了理清这两个受体在进化上的位置，研究者对35个已完成基因组测序的后生动物（从无脊椎动物到脊椎动物）进行了大规模同源基因搜索，共获得65个胰岛素受体同源物。使用ClustalW2进行多序列比对，并利用MEGA 5.0软件采用最大似然法构建了系统进化树。这一分析的关键在于，通过纳入广泛的物种和数据，揭示了胰岛素受体基因在后生动物中的宏观演化图景。
流程三：时空表达谱分析。 为了了解两个基因在发育过程中的功能线索，研究采集了赤拟谷盗8个关键发育阶段（早期胚胎、晚期胚胎、早期幼虫、晚期幼虫、早期蛹、晚期蛹、早期成虫、晚期成虫）的样品，每个阶段取3个个体混合提取总RNA。通过定量实时荧光PCR技术，以核糖体蛋白S3基因作为内参，分析了Tcas-IR1和Tcas-IR2在各阶段的转录水平。该方法可以精确量化基因表达的动态变化。
流程四：RNA干扰功能验证。 这是本研究的核心功能实验，分为幼虫期敲低和蛹期敲低两部分。 * 靶点设计与dsRNA合成： 为确保敲低的特异性，研究者选择了Tcas-IR1和Tcas-IR2之间序列相似度较低的区域（核苷酸一致性仅为44.6%，最长连续相同序列仅7 bp）来设计双链RNA。分别为Tcas-IR1（针对第971-1708位核苷酸）和Tcas-IR2（针对第2469-3222位核苷酸）合成了特异的dsRNA。 * 幼虫期RNAi实验： 约30头晚期幼虫被注射200 ng的特异性dsRNA。设立仅注射缓冲液的对照组和未注射的野生型对照组。注射5天后，通过qPCR验证基因敲低效率。随后持续观察并记录昆虫的死亡率、发育停滞表型直至成虫期。 * 蛹期RNAi实验： 由于幼虫期敲低Tcas-IR1导致高死亡率，为研究其对繁殖的影响，改为对5日龄蛹进行注射（每蛹200 ng dsRNA）。同样设立对照组。注射后，让成功羽化的成虫进行单对交配，连续收集3天的卵，统计每雌每日产卵量、卵的孵化率以及子代幼虫数量，以此评估繁殖力。
流程五：下游信号通路初探。 为了探究两个受体可能作用的信号通路，研究者在幼虫RNAi实验的样品中，检测了16个下游基因的表达变化。这些基因包括经典IR通路的关键分子（如ERK、PI3K、FOXO），以及可能参与G蛋白偶联受体信号通路的分子（如PKC、JNK、CDC42、IKK、MEKK等）。通过qPCR分析比较dsRNA处理组与对照组中这些基因的表达水平差异，从而推断两个Tcas-IR可能调控的信号网络。
流程六：数据分析。 所有qPCR数据均采用2^(-ΔΔCt)方法进行相对定量分析。表型数据和基因表达差异数据使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析或双因素方差分析，辅以Tukey事后检验。P值小于0.05视为具有统计学显著性。
第三部分：主要研究结果
系统进化揭示特异性复制事件： 构建的系统进化树清晰地显示，脊椎动物的胰岛素受体分化为IR、IGFR和IRR三个主要分支。而在昆虫中，大多数物种只有一个IR拷贝。然而，在膜翅目（蜜蜂、蚂蚁）、鞘翅目（赤拟谷盗）和半翅目（蚜虫）分化之前，发生了一次独立的胰岛素受体基因复制事件，导致这些类群的昆虫拥有两个胰岛素受体基因。赤拟谷盗的Tcas-IR1与蚜虫的IR1及膜翅目昆虫的IR2聚为一支（簇I），而Tcas-IR2则与蚜虫的IR2及膜翅目昆虫的IR1聚为另一支（簇II）。这表明此次复制事件发生在这三个目昆虫的共同祖先中，且两个拷贝在后续的进化中分别被不同谱系继承。
表达模式呈现明显差异： qPCR结果显示，两个基因的表达具有显著的时空特异性。Tcas-IR1在晚期成虫期的表达量最高，其次是在早期蛹期；而在早期幼虫期表达最低。相反，Tcas-IR2在幼虫期（尤其是晚期幼虫）表达最为旺盛，其次是在晚期成虫期。这种差异化的表达模式强烈暗示Tcas-IR1和Tcas-IR2在赤拟谷盗的蛹期发育/成虫繁殖和幼虫生长中分别扮演着更重要的角色。
RNAi揭示迥异的发育与繁殖表型：
下游信号通路既有重叠又有区别： 对下游基因表达的分析发现，敲低任一个Tcas-IR基因，都会导致PKC、FOXO、JNK、CDC42、IKK和MEKK 基因的表达上调，并导致ERK 基因的表达下调。这表明两个受体共享一部分相同的下游调控网络。然而，差异也很明显：敲低Tcas-IR1特异地导致了AC、AKT和PI3K 基因的上调，而敲低Tcas-IR2则特异地引起了PKA 基因的上调。这提示，尽管存在共同的调控节点，但Tcas-IR1和Tcas-IR2也通过部分独特的信号传导途径发挥作用。例如，Tcas-IR1可能更紧密地与PI3K-AKT经典通路耦合，而Tcas-IR2可能涉及不同的调控分支。
第四部分：研究结论与意义
本研究得出结论：在赤拟谷盗中，存在着两个源自共同祖先基因复制的胰岛素受体Tcas-IR1和Tcas-IR2。它们在进化上分属不同的簇，表达模式存在发育阶段特异性，在功能上发生了显著分化。Tcas-IR1是调控赤拟谷盗幼虫-蛹发育转换和成虫繁殖（尤其是卵子发生）的关键必需基因，其功能更接近于果蝇中那个唯一的胰岛素受体。Tcas-IR2则在幼虫生长和繁殖力维持中起辅助性作用。在分子机制上，两者通过部分重叠但又有所区别的信号通路发挥作用，共享对ERK、JNK/FOXO等核心节点的调控，但在PI3K-AKT等通路的关联上存在差异。
本研究的科学价值在于：首先，通过详实的进化分析，明确了在鞘翅目、膜翅目和半翅目昆虫祖先中发生了一次独立的胰岛素受体基因复制事件，丰富了我们对昆虫重要信号通路元件进化历史的认识。其次，首次在非社会性昆虫模型中系统比较了两个胰岛素受体旁系同源基因的功能，提供了基因复制后功能歧化的一个具体案例，表明复制产生的基因拷贝可以通过表达模式的分化和信号通路的细微调整，来承担原有基因的部分功能并演化出新的调控侧重。最后，研究结果将赤拟谷盗的胰岛素受体信号通路与关键的发育、繁殖表型直接联系起来，为深入理解IIS通路在完全变态昆虫中的调控网络奠定了重要基础。
第五部分：研究亮点
第六部分：其他有价值的内容
研究中关于下游通路的发现颇具启发性。除了验证经典IIS通路组分（如ERK、PI3K、FOXO）的响应外，还发现一些通常与G蛋白偶联受体信号或细胞应激、免疫相关的基因（如CDC42、IKK、MEKK）的表达也受到Tcas-IR敲低的影响。这暗示昆虫的胰岛素受体信号网络可能比已知的更为复杂，与其他细胞过程存在广泛的交叉对话。这为未来的研究指明了方向，即深入解析这两个受体如何整合不同信号输入以精确调控昆虫的生长发育。此外，论文提及敲低胰岛素受体可能通过影响保幼激素水平来影响卵黄发生，这连接了IIS通路与昆虫另一核心激素通路，显示了内分泌调控网络的复杂性。