本研究由美国橡树岭国家实验室生物科学部的Haiwei Lu、Sara Jawdy、Jin-Gui Chen、Xiaohan Yang以及Udaya C. Kalluri（通讯作者）共同完成。该研究发表于《Scientific Reports》期刊，在线发表日期为2025年，具体卷期号为第15卷，文章编号1320。
学术背景 本研究属于植物生物技术与合成生物学交叉领域，具体聚焦于木本多年生能源作物——杨树（Populus）的遗传转化技术优化。数十年来，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的植物转化技术是推动基础与应用植物生物学发展的关键工具。近年来，合成生物学的兴起进一步强化了对高效植物转化技术的需求，因为合成生物学的核心“设计-构建-测试-学习”（DBTL）循环依赖于快速、高效的遗传操作。然而，包括许多重要粮食、纤维和能源作物在内的众多植物物种，普遍存在组织培养困难（高顽拗性）和转化效率低下的长期瓶颈，这与合成生物学对快速迭代的需求严重不匹配。
在杨树中，尽管已建立转化体系，但现有协议主要使用地上部分组织（如叶片、茎段、叶柄）作为外植体，且不同物种或杂交种的最佳外植体来源不同。相比之下，在拟南芥等草本模式植物中，根外植体已被成功用于转化，并显示出某些优势（如更高的单T-DNA插入率）。杨树的根细胞已被证明具有器官发生能力，但尚未有研究系统性地比较和评估包括根在内的多种外植体来源对杨树遗传转化效率的影响，也缺乏对相关分子机制的深入解析。因此，本研究旨在通过拓展可用于杨树转化的外植体来源（特别是利用地下部分组织），最大化单位植株材料的利用率，提高转化生产力，并利用转录组学揭示影响再生与转化效率的潜在分子因素，最终为加速杨树合成生物学研究和作物改良提供新策略。
详细研究流程 本研究包含三个主要部分：1）不同外植体类型的再生与转化效率评估；2）转基因植物的表型分析；3）叶片与根外植体在早期器官发生过程中的转录组比较分析。
1. 组织培养、植物转化与转基因植株生产 * 研究材料与处理： 研究使用杂交杨无性系717-1B4（P. tremula × P. alba clone INRA 717-1B4）的组培苗。从6-8周龄的组培苗上，使用手术刀采集五种外植体：叶片、叶柄、茎（节间）、节和根。 * 转化与再生流程： 所有外植体与携带eYGFPuv报告基因的根癌农杆菌菌株GV3101共培养两天。共培养后，外植体经无菌水清洗，转移到添加了10 µM NAA和5 µM 2IP的愈伤组织诱导培养基上，在黑暗中培养三周。随后，外植体被转移到添加了0.2 µM 噻苯隆（TDZ）的芽诱导培养基上，在光照下培养八周。接着，将材料转移到添加了0.1 µM 6-苄氨基嘌呤（BAP）的芽伸长培养基上培养四周。最后，将伸长的芽切下，转移到添加了0.5 µM 吲哚-3-丁酸（IBA）的生根培养基上诱导生根。在整个再生过程中，使用50 mg/L的卡那霉素筛选转基因组织，并使用200 mg/L的替卡西林/克拉维酸抑制农杆菌生长。 * 实验设计与样本量： 研究进行了三次独立的转化实验。每次实验使用约100个外植体，涵盖了叶片、叶柄/茎和根三种类型（具体数量见补充表S1）。再生率定义为在芽诱导阶段结束时产生再生芽的外植体总数与初始外植体总数的比值。转化率定义为获得的独立转基因事件（每个愈伤组织仅取一个芽）总数与共培养农杆菌的外植体总数的比值。统计显著性使用R语言进行方差分析（ANOVA）检验。
2. 转基因植物的温室表型研究 * 研究流程： 将组培获得的转基因植株进行为期四周的炼苗（逐步降低湿度适应环境），然后移栽到温室盆栽混合基质中。植株在25°C、50-70%湿度、16小时光周期的温室条件下生长。 * 表型测定： 监测eYGFPuv报告基因在温室条件下的持续表达，并测量了不同外植体来源的转基因植株的株高、茎粗、叶片鲜重和茎鲜重等生理指标，以评估其生长是否可比。
3. RNA-seq文库构建、测序与数据分析 * 样本采集： 分别采集叶片和根外植体在四个时间点的样本进行RNA提取：1）刚从组培苗切下时（新鲜外植体）；2）在愈伤组织诱导培养基上培养三周后；3）在芽诱导培养基上培养一周后；4）在芽诱导培养基上培养两周后（见补充图S1）。每个时间点每种外植体类型设置三个生物学重复，共构建24个RNA-seq文库。 * 测序与数据处理： RNA-seq在DNBseq平台上进行。获得的清洁读段使用STAR软件（版本2.7.8a）比对到毛果杨（Populus trichocarpa v4.1）基因组。使用TPMCalculator计算基因表达量（TPM）。差异表达基因（DEGs）分析使用Trinity软件包中实现的DESeq2工具进行，筛选标准为错误发现率（FDR）< 0.05且对数倍数变化（log2 fold change）绝对值 > 1。 * 数据分析方法： 使用主成分分析（PCA）和样本间距离热图评估样本间的整体转录组相似性。通过维恩图分析叶片和根外植体在连续时间点比较中DEGs的重叠情况。特别关注了与器官发生密切相关的激素（生长素和细胞分裂素）信号通路基因以及已知在拟南芥等模式植物中调控器官发生的发育相关基因（如PLT3/5/7, CUC1/2, WOX11/12, WOX5/7, WUS等）的表达模式。
主要研究结果 1. 根外植体表现出与其他外植体类型相当的转化效率 * 再生能力： 所有测试的外植体类型（叶、叶柄/茎、根）均能形成愈伤组织和芽（图1a）。平均再生率分别为：叶片94.3%，叶柄/茎64.7%，根52.4%（图1b）。尽管根外植体的芽再生在观察时间点上看起来较慢，但统计检验（ANOVA）表明，不同外植体类型间的再生率（p = 0.0905）和转化率（p = 0.356）差异均不显著。仅在学生t检验比较叶片和根的再生率时发现了显著差异（p = 0.029）（补充表S1）。 * 转化效率： 通过eYGFPuv荧光观察（图2a），从叶片、叶柄/茎和根外植体获得转基因芽的平均转化率分别为25.0%、17.6%和15.0%（图2b）。尽管根外植体的平均转化率数值上略低，但统计上无显著差异。 * 转基因植株表型： 温室生长条件下，所有来源的转基因植株均持续表达报告基因，并且在株高、茎粗、叶片鲜重和茎鲜重等生长性状上无显著差异（补充图S2），表明不同外植体来源的转基因植株在形态和生长上具有可比性。
2. 叶片和根外植体在早期器官发生过程中共享重叠的转录组变化 * 整体转录组模式： PCA和样本距离热图将样本分为三大类：直接从组培苗切下的叶片外植体、直接从组培苗切下的根外植体，以及经过培养产生愈伤组织或芽的外植体（图3a, b）。这表明，在经历组织培养过程后，不同来源外植体的生理状态在愈伤组织阶段发生了“重置”，变得相似，而与初始器官类型无关。 * 差异表达基因： 在研究的四个时间点内，叶片和根外植体中分别有41.6%和25.8%的基因差异表达。随着器官发生的进行，两种外植体中DEGs的数量均逐渐减少。时间点对比的维恩图分析显示，在连续的时间点比较中，叶片和根外植体有9.2%到40.8%的DEGs是共享的（补充图S3），表明二者在分子响应上既有共性也有特性。
3. 激素与发育相关基因在早期器官发生中的表达 * 生长素相关基因： 共发现73个与生长素相关的基因在叶片和/或根外植体中差异表达，其中35个是两者共有的（图4a, b，补充表S4）。 * 细胞分裂素相关基因： 共发现12个与细胞分裂素相关的基因差异表达，其中8个是两者共有的（图5，补充表S5）。 * 发育相关基因： 研究检测了17个杨树基因（对应11个拟南芥发育调控基因同源物）的表达（表1）。其中9个基因（分别与拟南芥的PLT3/5/7, CUC1/2, WOX11/12, WOX5/7, 和WUS同源）在叶片和/或根外植体中差异表达（图6）。例如，在愈伤组织诱导阶段，PtPLT3/5/7的同源基因被诱导表达；在芽诱导阶段，PtWUS的同源基因被诱导表达。这些基因的表达模式与拟南芥中已知的器官发生调控网络有相似之处。
结论 本研究系统性地评估了杨树不同器官（叶、茎、叶柄、根）作为外植体用于根癌农杆菌介导的稳定遗传转化的可行性。结果表明，根外植体与地上部分组织一样，可以作为杨树遗传转化的可行外植体来源。由此产生的转基因植株在形态、报告基因表达和转录组谱方面具有高度可比性。这一发现拓展了杨树转化中可利用的外植体范围，为最大化单位植株材料的利用率、提高稳定转化生产力提供了切实可行的新途径。
转录组分析进一步揭示了在早期器官发生过程中，叶片和根外植体共享了相当一部分的分子响应，特别是生长素和细胞分裂素信号通路以及关键发育调控基因（如PLT, CUC, WOX, WUS家族基因）的表达变化。这为理解杨树再生的分子基础提供了宝贵数据。研究鉴定出的高潜力候选基因，未来可通过功能验证，用于开发新的分子工具，以克服组织培养顽拗性，进一步提高转化效率。
研究亮点 1. 研究思路的创新性： 首次在杨树中系统性地比较了包括根在内的多种外植体来源的再生与转化效率，挑战了传统转化协议主要依赖地上部分外植体的惯例，提出了“全植株利用”以提高转化生产力的新思路。 2. 结论的实践价值： 明确证实了根外植体在杨树稳定转化中的适用性，为杨树遗传转化实验提供了更灵活的材料选择方案，尤其适用于地上部分材料有限或特定基因型地上部分再生困难的情况。 3. 分子机制的深入探索： 不仅进行了表型效率评估，还通过多时间点的转录组测序，从分子层面揭示了不同外植体在再生过程中的共性响应和特异性，将表型观察与基因表达网络联系起来，为后续的机理研究奠定了基础。 4. 数据的全面性与参考价值： 研究提供了详细的转化效率统计数据、转基因植株表型数据以及一个宝贵的转录组数据集（已提交NCBI SRA，编号PRJNA1093501），这些资源对杨树及木本植物转化和再生研究领域具有重要的参考价值。
其他有价值内容 研究在讨论部分将当前发现置于更广阔的植物合成生物学与转化技术发展背景下。指出当前植物稳定转化技术的效率瓶颈严重制约了合成生物学DBTL循环的快速迭代。除了优化外植体利用策略，未来还需要结合新兴的稳定/瞬时转化方法、无细胞系统，并利用自动化和人工智能（AI）等前沿技术，形成“多管齐下”的策略，才能从根本上实现植物遗传转化过程的通量化、高效化，最终加速作物改良进程。本研究为这一宏大目标贡献了一个具体且有效的技术优化方案和分子层面的见解。