大麦耐盐新机制：miR164d-HvNAC92-HvHKT1;5模块的发现与功能解析
作者及机构
本研究的通讯作者为湖南农业大学的Wu Dezhi（邮箱：wudezhi@hunau.edu.cn），合作单位包括湖南农业大学农学院、岳麓山实验室、澳大利亚阿德莱德大学Waite研究所及浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所。研究团队由Kuang Liuhui、Zhou Hongxing等多名学者组成，成果于2025年12月23日发表在*PNAS*期刊（Volume 122, Issue 52, Article e2514555122），标题为《MicroRNA164d suppresses the HvNAC92-HvHKT1;5 module to enhance salinity tolerance in barley》。
学术背景
研究领域与动机
土壤盐渍化威胁全球约2300万公顷灌溉农田和1.5亿公顷雨养农田，导致作物遭受离子毒性（ionic toxicity）、渗透胁迫（osmotic stress）和氧化损伤（oxidative damage）。禾本科作物（如水稻、小麦、玉米和大麦）的耐盐性差异显著，其中大麦被认为是最耐盐的谷物（可耐受300 mM NaCl）。然而，大麦的耐盐机制与其特有的HvHKT1;5钠离子转运蛋白功能密切相关——与水稻和小麦中HKT1;5介导的“根-茎钠离子外排”不同，大麦HvHKT1;5反常地促进“根-茎钠离子转运”，从而降低耐盐性。因此，解析HvHKT1;5的调控机制对理解大麦耐盐分子基础至关重要。
科学问题与目标
本研究旨在揭示：（1）大麦如何通过转录后调控抑制HvHKT1;5的功能；（2）是否存在新的耐盐模块可协调钠钾离子稳态。团队重点关注microRNA（miRNA）介导的调控网络，特别是miR164家族（已知参与干旱、冷胁迫等响应，但其在盐胁迫中的作用尚未明确）。
研究流程与方法
1. miR164d的功能验证
- 实验设计：通过小RNA测序（miRNA sequencing）发现盐胁迫（200 mM NaCl）下大麦根部miR164d显著诱导表达。
- 转基因构建：构建miR164d过表达（OE）株系和CRISPR/Cas9敲除突变体（含9 bp、6 bp和1 bp缺失）。
- 表型分析：在8‰ NaCl土壤和200 mM NaCl水培条件下，miR164d-OE株系表现出更高的生物量和组织K⁺/Na⁺比，而敲除突变体相反。离子含量测定显示，OE株系茎部Na⁺含量降低55%，根-茎转运减少13%。
- 新技术：采用降解组测序（degradome sequencing）和5′ RLM-RACE验证miR164d对靶基因的切割位点。
2. 靶基因HvNAC92的鉴定与调控机制
- 靶标预测：通过psRNATarget工具预测miR164d靶标，结合降解组数据锁定NAC家族转录因子HvNAC92（切割位点位于其mRNA第871位核苷酸）。
- 双荧光素酶报告系统：在烟草叶片中证实miR164d特异性抑制HvNAC92的野生型CDS（编码序列），但对突变型（靶位点破坏）无影响。
- 时空表达分析：RT-qPCR显示HvNAC92在成熟根中高表达，盐胁迫下其表达先升后降，与miR164d呈负相关。
3. HvNAC92-HvHKT1;5模块的功能解析
- 遗传材料：构建HvNAC92敲除和过表达株系，发现敲除株耐盐性增强（茎Na⁺积累减少），而过表达株敏感。
- 全基因组靶标筛选：通过DNA亲和纯化测序（DAP-seq）鉴定HvNAC92结合的61,452个位点，其中5,257个基因的启动子区含保守NAC结合基序（如CAAGCA(C/T)）。
- 转录调控验证：酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率实验（EMSA）证实HvNAC92直接激活HvHKT1;5启动子的两个顺式元件（p1:TTTCTCGTGTAT；p2:GAAGAAGCCAAC）。
- 表型关联：HvHKT1;5敲除株表现出与miR164d-OE相似的耐盐表型，证实该模块负调控耐盐性。
4. 数据整合与模型构建
- 多组学分析：RNA-seq显示HvNAC92和miR164d突变体分别调控1,115和1,682个差异表达基因（DEGs），显著富集于膜转运活性通路。
- 机制模型：盐胁迫诱导miR164d表达→切割HvNAC92 mRNA→抑制HvHKT1;5转录→减少根-茎Na⁺转运并增强K⁺保留。
主要结果与逻辑链条
1. miR164d的盐诱导性：Northern blot和RT-qPCR证实miR164d在盐胁迫下持续高表达（图1A），其过表达株系茎Na⁺含量降低至野生型的0.55倍（图1J）。
2. HvNAC92的负调控作用：HvNAC92过表达株茎Na⁺积累增加1.83倍（图3N），且其敲除株HvHKT1;5表达量下降（图4H），表明HvNAC92是HvHKT1;5的正调控因子。
3. HvHKT1;5的功能悖论：与水稻OsHKT1;5不同，大麦HvHKT1;5促进Na⁺向茎部转运，其敲除株耐盐性增强（图6F），印证了物种特异性功能分化。
4. 模块的进化意义：系统发育分析显示HKT1;5蛋白在禾本科中高度保守，但大麦HvHKT1;5的189位亮氨酸（L189）多态性决定Na⁺转运活性（补充图S11）。
结论与价值
科学价值
1. 首次揭示miRNA-NAC-HKT调控模块在作物耐盐中的作用，拓展了非编码RNA在离子稳态中的功能认知。
2. 阐明大麦HvHKT1;5功能悖论的分子基础，为禾本科作物耐盐机制的多样性提供解释。
应用潜力
1. 分子育种靶点：通过编辑HvNAC92或HvHKT1;5可快速改良大麦耐盐性，无需复杂回交。
2. 跨物种应用：miR164-NAC模块在禾本科中保守，该策略可推广至水稻、小麦等作物。
研究亮点
1. 创新性发现：首次报道miR164d通过切割HvNAC92抑制HvHKT1;5表达，从而增强耐盐性。
2. 方法学贡献：整合降解组测序、DAP-seq和TS-CUT&Tag技术，建立多维调控网络解析流程。
3. 理论突破：挑战HKT1;5在单子叶植物中“普遍促进耐盐”的传统认知，提出功能分化模型。
其他价值
研究数据已存入Genome Sequence Archive（编号CRA025402），为后续研究提供资源。团队开发的CRISPR靶向编辑策略（如dCas9-TV激活miR164d）为作物精准改良提供新工具。