南京农业大学团队揭示NAC转录因子PmNAC32调控梅花光周期诱导开花的新机制
一、研究团队与发表信息
本研究的通讯作者为南京农业大学园艺学院果树生物技术实验室的高志红教授，第一作者为马成东博士。合作单位包括美国佛罗里达大学园艺科学系。研究成果于2025年6月23日发表于牛津大学出版社旗下期刊 *Horticulture Research*（2025年第12卷，文章编号uhaf157），并遵循知识共享许可协议（CC BY 4.0）。
二、学术背景与研究目标
科学领域：本研究属于木本植物开花调控的分子生物学领域，聚焦光周期信号传导机制。
研究背景：
1. 科学问题：多年生木本植物（如蔷薇科的梅花）需经历多年营养生长才能开花，其花芽诱导受光周期和温度调控，但具体分子机制尚不明确。
2. 前期基础：拟南芥中光周期通路已明确由光受体-生物钟蛋白-输出通路三部分组成，但木本植物的调控网络仍属空白。梅花（*Prunus mume*）因早春开花特性成为理想模型，但其夏季花芽诱导的分子机制尚未解析。
3. 研究目标：通过高通量转录组分析，鉴定梅花光周期响应关键基因，揭示其通过NAC转录因子家族调控花芽分化的分子通路。
三、研究流程与方法
1. 光周期响应基因筛选
- 实验设计：对梅花品种‘龙眼’进行长日照（LD, 16h光/8h暗）和短日照（SD, 8h光/16h暗）处理，在48小时内按4小时间隔采集52份叶片样本（4株×13时间点）。
- 技术方法：采用Illumina HiSeq 4000平台进行RNA-seq，通过Mfuzz聚类分析将基因划分为24个时序表达簇（LD和SD各12簇），结合KEGG和GO富集分析鉴定核心通路。
- 关键发现：鉴定出45个与生物钟基因共表达的转录因子，其中NAC家族成员LOC103325772（命名为PmNAC32）与多个核心振荡器基因显著相关（相关系数>0.8）。
2. PmNAC32功能验证
- 表达模式分析：
- qRT-PCR证实PmNAC32在SD条件下夜间表达升高，蛋白水平呈昼夜节律（Western blot）。
- 组织特异性显示其在成熟组织（花、黄叶）及早花品种中高表达（10个品种比较）。
- 功能实验：
- 拟南芥过表达：PmNAC32-OE株系在LD/SD下均提前抽薹（LD下较野生型早6天，叶片数减少4片）。
- 烟草转化：过表达株系开花提前15天。
- 梅花愈伤组织：过表达后下游开花基因PmCOL5上调、PmCOL4下调。
3. 上游调控机制解析
- 启动子分析：发现PmNAC32启动子含EE-box和CBS-box等光响应元件。
- 酵母单杂交（Y1H）与EMSA：证实生物钟蛋白PmRVE1/3可直接结合EE-box抑制PmNAC32转录。
- 双荧光素酶报告系统（D-LUC）：PmRVE1/3抑制PmNAC32启动子活性（荧光强度降低60%）。
4. 下游靶基因鉴定
- Y1H与EMSA：PmNAC32直接结合PmCOL5（激活）和PmCOL4（抑制）启动子的NAC结合位点（NACBS）。
- 拟南芥表型验证：PmCOL5-OE加速开花，PmCOL4-OE延迟开花，印证其功能对立性。
5. 同源蛋白协同作用
- 蛋白互作：酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）显示PmNAC32与同源蛋白PmNAC29/47形成异源二聚体。
- 复合体功能：三者协同增强对PmCOL4/5的调控（复合体结合活性较单体提高40%）。
四、主要研究结果
1. PmNAC32的光周期响应性：RNA-seq和qRT-PCR证实其表达受SD诱导，且蛋白水平昼夜波动，与早花品种表型正相关。
2. 上游调控网络：PmRVE1/3通过结合EE-box抑制PmNAC32，形成“光周期-生物钟-NAC”级联。
3. 下游通路：PmNAC32通过激活PmCOL5、抑制PmCOL4促进开花，且与PmNAC29/47协同放大效应。
4. 物种特异性：拟南芥同源基因AtJUB1/At3g12910无昼夜节律表达，提示木本植物进化出独特调控机制。
五、结论与价值
科学意义：
1. 首次揭示梅花光周期诱导开花的“PmRVE1/3-PmNAC32-PmCOL4/5”转录级联，填补木本植物光周期通路空白。
2. 提出NAC家族通过蛋白复合体增强调控的新模式，为理解转录因子功能冗余提供案例。
应用价值：
1. 为梅花花期分子育种提供靶基因（如编辑PmNAC32启动子元件可调控开花时间）。
2. 对蔷薇科果树（桃、樱等）的花期改良具有参考意义。
六、研究亮点
1. 技术创新：结合高分辨率时序转录组（48小时密集采样）与多物种遗传转化（梅花愈伤、烟草、拟南芥）。
2. 机制创新：发现NAC蛋白复合体协同调控下游基因的“放大器”效应。
3. 理论突破：解析木本植物特有的光周期-开花关联机制，区别于拟南芥的激素主导通路。
其他发现：
- 梅花中COL4/COL5功能分化与拟南芥保守，提示BBX家族功能在进化中部分保留。
- PmNAC29/47虽无光周期响应性，但通过蛋白互作参与开花调控，体现功能分工。
（注：全文未包含的补充数据可参考原文附图S1-S14及附表S1-S3。）