单细胞时序内皮细胞图谱揭示小鼠胚胎器官特异性血管发育的启动与调控
一、 作者、机构与发表信息
本研究由Lihui Lin, Jing Zhong, Fuqing Jiang等科研人员共同完成。研究团队主要来自中国科学院广州生物医药与健康研究院（Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences）、西湖大学（Westlake University）、华南理工大学（South China University of Technology）以及广州国家实验室（Guangzhou National Laboratory）等多家机构。通讯作者为Duanqing Pei, Shangtao Cao, Yang Liu, Guangdun Peng, Jiekai Chen和Qi Chen。该研究成果已于2026年3月5日在国际顶级学术期刊《Cell》（第189卷，1573–1590页）上作为“Resource”（资源）文章发表。
二、 学术背景与研究目的
内皮细胞是构成脊椎动物循环系统内壁的基础细胞类型，不仅负责物质运输和免疫监视，还在器官发育中扮演至关重要的角色。尽管血管生成的普遍机制已有较多研究，但对于器官特异性血管如何发育，以及不同器官内皮细胞在胚胎期如何获得其独特的转录组特征（即“器官型”分化），人们仍知之甚少。近期的单细胞RNA测序研究揭示了成年小鼠不同器官的内皮细胞在转录组水平上具有显著的器官特异性，但这一过程是何时、如何起始的，其关键调控因子是什么，以及内皮细胞失去器官型特征是否会影响相应器官的发育与再生，这些根本性问题仍未得到解答。
为解决上述问题，本研究旨在构建一个覆盖小鼠整个胚胎发育时期的、单细胞水平的内皮细胞时序图谱。该图谱将实现对多个器官、连续时间点的内皮细胞转录组进行系统性比较，以期达到以下目标：1）确定内皮细胞启动器官特异性分化的精确时间点；2）揭示器官型内皮细胞的谱系发育轨迹；3）识别器官特异性内皮细胞中富集的基因和信号通路，并将其与器官功能相关联；4）通过跨物种比较（人与小鼠），探寻进化上保守的发育路径；5）利用图谱资源预测并验证调控器官特异性血管发育的关键因子。最终，研究希望为血管生物学领域提供一个强大的数据资源，并深入阐释内皮细胞器官型分化的基本原理和分子机制。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一项系统性工程，整合了大规模单细胞测序、时空转录组学、遗传学模型构建及功能验证等多个层面。其核心流程可概括为以下五个主要步骤：
1. 构建“单细胞时序胚胎发育内皮细胞图谱” * 研究对象与样本收集：研究人员从胚胎第1.5天（E1.5）开始，以0.5天为间隔，连续收集小鼠胚胎样本直至E19.0，覆盖了整个胚胎发育过程。从中期胚胎阶段开始，采用组织标签技术（Tissue Tag）对头部、躯干、内脏和皮肤进行标记区分。 * 单细胞RNA测序与细胞鉴定：对所有捕获的细胞进行单细胞RNA测序。通过无监督聚类并结合内皮细胞评分，从总共测序的细胞中定义了70,915个高质量的内皮细胞。这些细胞均表达典型的内皮标记物，如Cdh5、Pecam1和Kdr。样本的采集时间点和组织标签信息被用于后续分析。 * 器官型内皮细胞注释：研究建立了一套迭代注释流程，结合组织标签信息、无监督细胞聚类、随机森林分类器以及已知的成年器官型内皮细胞分子标记物，对胚胎内皮细胞进行精细化分类。最终，内皮细胞被划分为未器官型内皮细胞、中枢神经系统内皮细胞、肺内皮细胞、淋巴管内皮细胞、心内膜内皮细胞、肝内皮细胞、胃肠内皮细胞、肾内皮细胞、肌肉与皮肤内皮细胞、未器官型动脉内皮细胞以及内皮-间质转化细胞等多个亚群。 * 资源建立与验证：通过此流程，研究成功构建了“单细胞时序胚胎发育内皮细胞图谱”。为验证注释的准确性，研究团队进行了免疫染色和基于微流控索引的空间ATAC与RNA测序，确认了预测的器官特异性标记物（如肺内皮标记物Scn7a）在相应器官原位表达。此外，将已发表的不同器官内皮细胞数据集投影到该图谱中，也证实了它们能准确地映射到对应的位置。该图谱已建立公开网站（http://sted-ec.ccla.ac.cn）供全球研究者使用。
2. 利用图谱分析器官特异性分化的起始与动态变化 * 分化起始时间判定：为了确定内皮细胞获得器官型转录组特征的时间点，研究团队使用成熟器官型内皮细胞的组合分子标记物集，对发育过程中内皮细胞的“器官特异性分化成熟度”进行评分。通过比较评分与真实发育时间点，发现该评分系统能有效评估内皮细胞的分化水平。结果显示，在不同器官中，成熟度评分在胚胎早期保持低水平且稳定，但在特定的中期胚胎时间点（E9.0-E13.5之间）开始不可逆地上升，标志着器官型内皮细胞的初始出现。这一预测通过免疫染色在相应发育时间点对关键标记物（如肺中的Foxf1）的表达进行验证，并绘制了各器官型内皮细胞初始出现的时间线。 * 谱系轨迹预测与转录组差异量化：研究应用了基于最优传输理论的算法Moscot，从晚期胚胎状态反向追溯，预测了各器官型内皮细胞从早期祖细胞开始的潜在分化路径。结果显示，除了心内膜内皮细胞路径较独特外，其他器官的内皮细胞在E9.0之前共享相似的分化路径，之后才发生分歧，进一步支持中期胚胎是器官型分化起始的关键阶段。同时，通过皮尔逊相关系数分析定量比较了不同器官、不同时间点内皮细胞之间的转录组差异，揭示了从中期胚胎开始，差异逐渐扩大，并在晚期胚胎接近成年器官型内皮细胞的差异水平。器官内部的时序比较还识别出了各器官内皮细胞分化的关键时期（如肺内皮细胞在E17-E19期间发生剧烈转变）。
3. 多器官基因与通路比较揭示功能关联 * 基因表达模式分析：研究分析了所有内皮细胞的基因表达趋势，将其归纳为四个模块。不同器官型内皮细胞中这四个模块的基因比例存在显著差异，表明基因的激活与抑制模式具有强烈的器官特异性。 * 通路富集分析：通过比较同一器官在器官型特征初现期（E13.5）和晚期胚胎期（E18.5）内皮细胞的差异表达基因，并与器官型内皮细胞富集基因取交集，识别出一系列基因。对这些基因的基因本体论（GO）和Reactome通路分析发现，富集的信号通路高度相关于对应器官的功能。例如，心内膜内皮细胞富集心脏腔室发育通路，中枢神经系统内皮细胞富集溶质载体介导的跨膜运输通路，肝内皮细胞富集氨基酸代谢和激素合成通路，淋巴管内皮细胞富集淋巴结发育和抗原呈递通路。 * 关键因子与细胞间通讯预测：图谱详细比较了紧密连接蛋白、转录因子、血管分泌因子（Angiocrine Factors）等在各个器官内皮细胞中的表达差异，并利用SCENIC分析预测了调控网络。这些差异可能部分解释了器官特异性的内皮-上皮或内皮-间质细胞间的信号交流。
4. 跨物种时间序列比较：以肺为例 * 数据整合与轨迹分析：为了探究发育过程的进化保守性，研究整合了已发表的人胚胎肺发育单细胞RNA测序数据集（涵盖妊娠后5至22周）。通过数据整合方法比较，发现人和小鼠的肺内皮细胞在整合后的降维图中呈现高度相似的分布趋势。轨迹分析显示，两种物种的肺内皮细胞沿着非常相似的路径分化，并存在保守的内皮亚群（如Car4+/Tbx2+毛细血管内皮细胞）。 * 发育阶段对齐与基因表达差异：研究将人和小鼠的肺发育阶段（胚胎期、假腺期、小管期、囊泡期）进行对齐，发现两种物种的肺内皮细胞均在“小管期”发生关键的转录组转变。然而，在基因表达模块分析中，人和小鼠肺内皮细胞仅有约28.9%的基因表达趋势相似，且在肺内皮细胞富集的前200个基因中，仅有35.7%是共有的。细胞通讯分析也显示存在物种特异性的信号交流模式。这表明，尽管发育轨迹保守，但具体的分子调控网络存在差异，提示利用小鼠模型研究人类疾病时，应聚焦于保守的关键基因。
5. 关键调控因子的预测与功能验证：以Casz1为例 * 预测与表达验证：通过图谱分析，研究预测转录因子Casz1是一个在小鼠和人肺内皮细胞中均富集的因子。利用Casz1基因敲入报告小鼠（Casz1-em1-Zyliu），通过HA标签的免疫荧光染色，证实Casz1蛋白特异性地在肺内皮细胞中表达，而在肝、心、脑的内皮细胞中不表达。 * 内皮特异性基因敲除模型的表型分析：通过将Cdh5(pac)-CreERT2小鼠与Casz1条件性敲除小鼠杂交，构建了他莫昔芬诱导的内皮细胞特异性Casz1敲除小鼠。在E15.5，敲除小鼠肺部的血管化面积显著减少；到E18.5，肺内Car4+毛细血管内皮细胞比例大幅下降，表明肺内皮细胞分化异常。这些血管缺陷持续到出生后。 * 分子机制探索： * 单细胞转录组分析：对敲除和对照小鼠E18.5肺细胞进行单细胞测序，证实了Car4+内皮细胞的减少。更重要的是，将敲除内皮细胞的转录组与图谱中不同时间点的正常肺内皮细胞进行相似性比较，发现敲除内皮细胞的转录组特征类似于E16.0之前的细胞，表明Casz1缺失阻碍了肺内皮细胞从小管期的关键转录转变。 * 差异基因与通路分析：差异表达基因分析显示，Casz1调控了大量与血管生成、肺毛细血管亚群形成以及肺内皮器官型分化相关的关键基因（如Vegfa, Kdr, Foxf1, Tmem100, Car4等）。GO分析表明这些基因富集于VEGF信号、血管生成和肺发育等通路。 * 染色质结合分析：通过CUT&Tag技术检测了肺内皮细胞中Casz1的染色质结合位点，发现Casz1主要结合在启动子区域，并直接结合在多个关键差异基因（如Vegfa, Kdr, Foxf1, Tbx2, Car4）的染色质区域，证实了其直接转录调控作用。 * 体外功能验证：在人工脐静脉内皮细胞中过表达或敲低Casz1，能引起相反的转录组变化和细胞行为改变（迁移和成管能力），进一步验证了其功能。 * 内皮-上皮通讯缺陷：Casz1敲除小鼠还表现出肺上皮细胞数量减少、增殖能力下降。单细胞测序和细胞通讯分析显示，敲除后内皮细胞与上皮细胞之间的信号交流强度和数量普遍降低。研究发现，Casz1直接结合并调控血管分泌因子Fgf1的表达，而Fgf1在敲除小鼠内皮细胞中表达显著下调。体外共培养实验表明，内皮细胞中Casz1的敲低会损害共培养上皮细胞的增殖，而添加Fgf1能部分挽救这一缺陷，证明Casz1通过调控Fgf1等因子影响内皮-上皮通讯，进而协调肺的整体发育。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究取得了一系列环环相扣的重要结果： 1. 成功构建了首个覆盖小鼠全胚胎期、多器官的单细胞时序内皮细胞图谱。这是所有后续分析的基础，其高质量的数据和准确的细胞注释为深入研究提供了可靠的“地图”。 2. 明确了器官型内皮细胞分化的“启动窗口期”。结果发现，大多数器官的内皮细胞在胚胎中期（约E9.0-E13.5）开始获得可区分的器官特异性转录组特征，这一发现回答了“何时分化”这一核心问题，并将研究焦点引向这一关键时期。 3. 揭示了器官型内皮细胞的基因和通路特征与其所在器官的功能高度相关。这一结果将内皮细胞的分子表型与生理功能直接联系起来，超越了以往仅将其视为被动管道系统的认知，强调了内皮细胞在器官发育中的主动调节作用。 4. 通过跨物种比较，发现了肺内皮细胞发育在轨迹和关键时期上的进化保守性，以及在具体基因表达网络上的物种差异性。这为利用小鼠模型研究人类肺血管疾病提供了重要的参考依据，提示应关注保守的核心调控程序。 5. 预测并验证了Casz1是调控肺特异性血管发育的关键转录因子。这是图谱资源应用于发现新生物学机制的典范。从图谱预测到体内外功能验证的完整链条证明：Casz1通过直接结合并调控一系列血管生成和肺内皮分化相关基因，驱动肺内皮细胞完成关键发育转变；同时，它通过调控Fgf1等血管分泌因子，影响内皮-上皮通讯，从而协调肺的形态发生。这一结果将“器官型分化启动”的机制具体化到一个可操作的分子靶点。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：内皮细胞的器官特异性分化是一个在胚胎中期启动、并在后期持续深化的过程。研究构建的“单细胞时序胚胎发育内皮细胞图谱”是一个强大的资源平台，能够实现多器官、全时程的内皮细胞比较，从根本上推进了我们对器官特异性血管发育的理解。
其科学价值体现在： 1. 资源价值：提供了首个系统性、高精度的胚胎内皮细胞发育全景图，是血管生物学、发育生物学和再生医学领域的宝贵数据资产。 2. 机制突破：明确了器官型内皮细胞分化的起始时间窗口，并揭示了转录因子Casz1在肺血管发育和内皮-上皮协同中的核心调控作用，为理解器官特异性血管生成的分子开关提供了关键线索。 3. 范式创新：展示了如何将大规模单细胞图谱与经典遗传学模型深度结合，从相关性预测走向因果性验证的研究范式，为未来利用类似资源发现新基因功能提供了模板。
潜在的应用价值包括：为先天性血管畸形、器官发育不良等疾病的病因研究提供线索；为基于血管的器官再生和类器官构建提供分子靶点和发育时序参考。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究也坦诚地指出了其局限性：由于采用无偏倚的取样策略而非重新平衡的策略，图谱未能涵盖所有器官（如骨髓、脾脏、胰腺等），这些器官在胚胎期体积过小或发生较晚。此外，本研究聚焦于内皮细胞的器官型分化，未深入探讨血管发生、动静脉分化等其他重要的血管生物学方面。研究团队建议其他使用者需根据自身数据特点谨慎选择分析方法，并强调了未来测序技术进步将有助于捕获更低表达的基因。这些说明体现了研究的严谨性和开放性。