学术报告：基于毒素-抗毒素系统的重组质粒稳定性研究及其在大肠杆菌中的表达应用

研究的主要作者与机构，以及期刊信息

本文由 Anxiang Chen、Yuguo Dong、Huaigu Jiang、Min Wei、Yuhong Ren 和 Jian Zhang 等研究者完成，隶属于East China University of Science and Technology (ECUST)的State Key Laboratory of Bioreactor Engineering研究团队。文章发表在Molecular Biology Reports（2024年第51卷：939），DOI为[10.1007/s11033-024-09881-z]。

研究背景

质粒是大肠杆菌（Escherichia coli）异源蛋白表达中最常用的载体。然而，生产中的异源蛋白表达常因质粒的不稳定性而导致质粒拷贝数的减少，从而显著降低蛋白产量。工业生产中，抗生素冻结技术是传统的方法以防止质粒丢失，但这种方式不仅增加了生产成本，还对环境带来了潜在威胁。因此，科学家希望开发新的质粒稳定化系统，以提高重组蛋白的产量。

毒素-抗毒素系统（Toxin-Antitoxin，简称TA系统）是细菌和古细菌中广泛存在的一种自杀调控机制。该系统以质粒丢失后选择性杀伤的方式，主动维护携带抗生素抗性质粒的稳定性。这种机制能通过毒素蛋白干扰DNA复制、抑制蛋白质合成及破坏细胞膜等途径阻止质粒缺失的子代细胞存活。本研究旨在深入探索TA系统特别是hok/sok系统及其分子机制，并开发基于该系统的质粒稳定化方案。

研究流程与实验设计

本研究细分为以下步骤：

1. 构建质粒稳定化系统并筛选最优毒素-抗毒素系统：

   • 作者选择了三种不同的TA系统（hok/sok、parde、pard）用于构建质粒稳定化系统。
   • hok/sok属于I类TA系统，主要机制是通过sok基因编码的反义RNA（antisense RNA，简称asRNA）抑制由hok基因编码的毒素蛋白合成。
   • parde 和 pard 属于II类TA系统。其毒素蛋白通过与抗毒素蛋白形成二聚体实现细胞杀伤的调控机制。
   • 研究者利用同源重组技术将三种系统分别插入表达载体pet28a(+)中，并以红色荧光蛋白（mCherry）为模型蛋白，构建出四株菌株：野生型（BES）及分别含有hok/sok（BES01）、pard（BES02）、parde（BES03）系统的菌株。

2. 在振荡瓶水平评估系统功效：

   • 通过Luria-Broth培养基和红色荧光蛋白表达实验，分别测定四种菌株的质粒保留率、生物量及蛋白表达水平。
   • 进行了12小时的感应实验，在有抗生素和无抗生素两种条件下评估质粒稳定性和宿主生长情况。

3. 验证hok/sok系统机制：

   • 使用四环素（Doxycycline）处理，研究该药物对反义RNA分子与mRNA结合的影响。
   • 进一步利用RNAfold软件模拟反义RNA和mRNA的二级结构，并通过定点诱变降低RNA结合区的自由能，以评估其对质粒稳定性的影响。

4. 发酵罐水平验证hok/sok系统的功效：

   • 在5L发酵罐中对最优体系BES01菌株进行了异源蛋白表达实验，验证其质粒稳定性、蛋白产量及生物量。

5. 细胞活性和凋亡的进一步分析：

   • 为评估hok毒素蛋白对宿主细胞活性的影响，采用细胞活性测定（CCK-8）及凋亡分析技术（流式细胞技术）。

主要研究结果

1. 质粒保留率和蛋白产量的提升：

   • 无抗生素条件下野生型BES菌株的质粒保留率仅为50.3%，而BES01、BES02和BES03菌株均达到100%。
   • hok/sok系统对宿主毒性相对最小，其菌株BES01的蛋白表达水平提升了53.01%。

2. 位置对质粒稳定化系统的影响：

   • 比较不同插入点的hok/sok基因，发现当插入位置靠近抗生素基因时，因可能的转录干扰导致蛋白表达水平降低了13.8%-18.2%。

3. doxycycline对hok/sok系统的影响：

   • 在不同浓度的doxycycline处理下，hok/sok+菌株比hok/sok−菌株对药物表现出更高的敏感性，蛋白水平下降了57.6%。显示外源抑制反义RNA会显著降低质粒稳定性和蛋白表达水平。

4. 降低RNA二级结构自由能对稳定性的影响：

   • 定点突变后，结合区自由能由原始的-12.80 kcal/mol显著减少到-5.70 kcal/mol。这种改变显著降低了质粒保留率（仅剩20.2%）和蛋白表达水平，表明RNA结构稳定性是关键影响因素。

5. 发酵罐实验验证：

   • hok/sok体系在发酵罐中的质粒保留率由野生型的21.1%提升到61.2%，蛋白表达水平增加了31.4%。

6. 细胞活性和凋亡分析：

   • 突变菌株BES04的细胞活性比BES01低25.2%，但凋亡率无显著差异，这说明错误的RNA结合导致了毒素蛋白的泄漏从而减少宿主生长率。

研究结论与意义

研究表明，hok/sok系统是一种有效的质粒稳定化体系，较parde与pard系统具有更强的质粒保留能力及更低的宿主毒性。尤其是在工业发酵条件下，hok/sok系统无需添加抗生素即可有效提升质粒保留率及异源蛋白表达水平。该体系的分子机制进一步揭示了反义RNA-mRNA结合区的二级结构稳定性在调控质粒稳定性过程中的关键作用。

本研究对工业生物工程领域中重组质粒的应用具有重要参考价值，不仅降低了生产成本，还减少了抗生素使用对生态环境可能的负面影响。

研究的亮点

1. 首次细致揭示了hok/sok系统分子机制中的RNA二级结构和结合自由能对质粒稳定化的影响。
2. 无需抗生素条件下，基于hok/sok毒素-抗毒素系统的质粒稳定化方案在发酵罐实验中表现出良好的工业应用价值。
3. 使用了先进的RNA自由能计算及定点突变技术，全面探索了RNA结合区对宿主细胞生长及产量提升的综合效应。

这项研究为进一步开发高效、环保、抗抗生素依赖的质粒稳定化技术奠定了坚实的基础，同时也为合成生物学和工业生物技术领域提供了新的契机与范式。